第20卷第7期2008年7月化学研究与应用Che m ical Research and App licati on Vol .20,No .7July,2008收稿日期:2007208209;修回日期:2008203209基金项目:国家自然科学基金项目(20375008,20475001)资助;广东省科技攻关项目(2004B33301024,2005B10301041,2006B12401011)资助;广东省自然科学基金项目(06108856)资助联系人简介:程发良(19672),男,教授,主要从事生物电化学研究。

Email:chengfl@dgut .edu .cn文章编号:100421656(2008)0720872204血红蛋白在纳米金修饰电极上的电化学研究张　敏1,程发良13,蔡志泉2,姚海军1(1.东莞理工学院生物传感器研究中心,广东　东莞　523106)(2.东莞理工学院城市学院,广东　东莞　523106)关键词:纳米金;牛血红蛋白;化学修饰电极中图分类号:O65711 文献标识码:A氧化还原蛋白在电极上的直接电化学研究不但能获得有关蛋白质和酶的热力学和动力学性质等重要信息,为开发新型生物传感器和生物反应器提供理论指导,而且对了解它们在生命体内的电子转移机理和生理作用机制具有重要意义。

血红蛋白(Hb )是以血红素为辅基的蛋白质,在生物体中的主要功能是运输O 2。

由于它的三维结构已经确定,所以常常用作研究蛋白质的结构与功能关系的模型物[1,2]。

HB 分子庞大,电活性中心血红素被四条肽链包围而不易暴露,且在常规电极上强烈吸附和变性,使得它在一般固体电极上的电子传递困难,需要借助媒介体[3]、促进剂[4]或特殊电极材料[5]促进电化学反应。

金属纳米粒子由于具有与其颗粒大小相关的特殊性质[6],如表面效应、体积效应、量子尺寸效应等,从而产生不同于相应块体材料的电学、光学、磁学和催化性能,逐渐为电分析化学领域广泛关注[7]。

文献曾报道了纳米金用于测定儿茶酚[8]、去甲肾上腺素[9]、葡萄糖[10211]等物质。

本文利用电化学沉积法制备了纳米金修饰电极,利用该修饰电极测定了血红蛋白,实验结果表明:纳米金具有良好的生物共容性[12],且纳米金较大的比表面积增强了血红蛋白在电极表面的吸附,显著提高了血红蛋白的电化学响应,实现了血红蛋白的直接电化学。

1　实验部分111　试剂和仪器牛血红白蛋白(国产,储备液在4℃条件下保存);氯金酸(HAuCl 4・3H 2O );实验用缓冲溶液为012mol/L Na Ac -HAc,pH 值采用混合不同比例的Na Ac 和HAc 溶液调整;实验所需的其余试剂均为分析纯;实验用水为二次蒸馏水;所有实验均在室温下进行。

P ARST AT2273电化学综合测试系统;电化学实验采用三电极体系:工作电极为裸玻碳电极(GCE )或者纳米金修饰电极(NG/GCE ),参比电极为饱和甘汞电极,对电极为铂电极;赛多利斯电子天平BS124S (北京赛多利斯仪器有限公司);超声波清洗器(昆山市超声波仪器厂);电子pH 计H I 98101(北京哈纳科仪科技有限公司)。

112　修饰电极的制备金溶胶的制备参照文献[13]。

将玻碳电极先用金相砂纸抛光,然后依次用110、013μm 的A l 2O 3在麂皮上抛光至镜面,再移入超声水浴中清洗,最后依次用1∶1乙醇、1∶1HNO 3和蒸馏水超声清洗。

把经过预处理的玻碳电极,用氮气吹干,置于金溶胶中于+115V 下电沉积2h 即可,标记为NG/GCE ,置于NaHc -HAc 缓冲溶液中备用。

113　实验方法电化学实验均在50mL 电解池中进行,用上述三电极系统,测定电化学曲线。

测试前需向溶液中通氮气20m in 以上,以除去溶液中的溶解氧。

所有实验均在室温下进行(约25℃)。

第7期张敏等:血红蛋白在纳米金修饰电极上的电化学研究2　结果与讨论211　血红蛋白在纳米金修饰电极上的电化学响应分别将裸玻碳电极、金溶胶修饰电极置于1×1025mol/L 的血红蛋白溶液(pH =416)中进行循环伏安扫描,结果如图1所示。

血红蛋白在裸玻碳电极上有一个很小的还原峰,氧化峰则不明显(如图1B )。

而在纳米金修饰电极上(图1A (a )),同样浓度的血红蛋白则有一对明显的氧化还原峰,氧化峰电位为01134V ,还原峰电位为2010144V,对应于血红蛋白中血红素辅基Fe 2+/Fe 3+的氧化还原反应。

相对裸电极,其峰电流也明显增大,说明纳米金可以促进血红蛋白与电极间的电子传递过程,此修饰电极很好地催化了血红蛋白的氧化还原。

图1(A )血红蛋白在不同电极上的循环伏安曲线 图1(B )血红蛋白在裸电极上的循环伏安曲线 Fig 11(A )cyclic volta mmogra m s of he mogl obin Fig 11(B )cyclic volta mmogra m s of hemogl obin at at different electr odes (a )bare GCE;(b )NG/GCE bare GCE212　条件实验21211底液选择　不同的支持电解质如012mol/L 的Tris 2HCl 、012mol/L 的磷酸盐、012mol/L 的B 2R 及012mol/L 的HAc 2Na Ac 缓冲溶液对血红蛋白在修饰电极上的循环伏安曲线表明:以在012mol/L HAc 2Na Ac 缓冲溶液中的峰形好,峰电流高,背景电流低,有最好的电流响应,故选其作为实验测定的底液。

21212　缓冲溶液pH 的影响　配置一系列不同pH 的HAc 2Na Ac 缓冲溶液,并分别加入不同浓度的KCl,以保证离子强度一致。

配制1×1025mol/L 血红蛋白溶液,研究扫描速度为100mV /s 时血红蛋白的电化学行为随pH 值的变化情况(图2)。

在实验的pH 范围内,发现血红蛋白的峰电流随着pH 值的增大无明显变化,而血红蛋白的峰电位值E p 随pH 的增加明显负移。

随pH 增加而负移的现象与水分子以及血红素周围氨基酸的质子化作用有关,称为氧化还原的玻尔效应[14]。

因为在蛋白质分子中同时存在着氧化还原中心和质子化位点,电子传递伴随质子转移的反应,会改变氧化态或还原态中心离子与质子化过程的静电作用,表现形式为氧化还原峰电势随溶液pH 值的增加而负移。

本实验选择pH 416的HAc 2Na Ac 缓冲溶液作为支持电解质。

图2　峰电位与pH 值的关系Fig 12　The relati onshi p bet w een the potential and pH21213　扫速的影响　如图3所示,考察了扫描速度对血红蛋白在修饰电极上的电化学氧化的影响。

从10mV /s 到300mV /s 的扫描速度进行扫描,阴极峰电流i pc 和阳极峰电流i pa 均随扫速的增大而增大,而且峰电流均与扫速成线性关系,线性方程分别为:i pc =2146994+0124614v ,相关系数r =0199925;i pa =2118948120122549v,r =20199945,378化学研究与应用第20卷说明血红蛋白在电极上的电化学过程是受表面控制的。

图3　峰电流与扫速的关系Fig 13　The relati onshi p bet w een thepeak currents and scan rate21214　沉积时间的影响　图4为不同沉积时间下,1×1025mol/L 牛血红蛋白(pH =416)以100mV /s 的扫描速度在金纳米修饰电极上的循环伏安曲线图。

结果表明,随着沉积时间的增加,血红蛋白的峰电流明显增大,当沉积时间达到2h 的时候,峰电流最大,显示沉积层已达到饱和,进一步延长沉积时间,峰电流没有明显变化,基本趋于稳定,这可能是在电极沉积的NG 粒子因相互堆积而长大、表面积反而减小的缘故。

本实验选择2h 作为沉积时间。

图4　沉积时间的影响Fig 14　affecti on of depositi on ti m e 时间从上往下依次为:2h,3h,1h,40m in,30m in,20m in,10m in21215　线性范围和检出限　图5是在优化实验条件下,牛血红蛋白在纳米金修饰电极上氧化峰电流与浓度的关系。

结果表明:在510×1025mmol/L ～510×1023mmol/L 范围内,氧化峰电流与浓度具有良好的线性关系:i pa (μA )=010981+217169c (相关系数R =019979)。

21216　修饰电极的重现性和稳定性　取同一根修饰电极对浓度为1×1025mol/L 的血红蛋白平行测定8次,峰电流值的相对标准偏差(RS D )为0185%,表明该修饰电极有很好的重现性;使用后的电极用水清洗,置于pH416的HAc —Na Ac 缓冲溶液中保存。

一周后将修饰电极置于含有1×1025mol/L 血红蛋白的HAc —Na Ac 缓冲溶液中进行测试,响应电流为开始的9817%,一个月后该电极的活性下降了约1316%,表明电极的稳定性较好,可以达到测试要求。

图5　血红蛋白浓度与氧化峰电流的关系Fig 15　Pl ot for concentrati on of Hbvs oxidati on peak current工作电极为纳米金修饰电极,参比电极为饱和甘汞电极,对电极为铂电极3　结论本文报道了血红蛋白在纳米金修饰电极上的直接电化学行为。

结果表明:纳米金粒子因其良好的生物共容性,且血红蛋白在纳米金上很强的吸附作用,而对血红蛋白具有很好的富集作用和催化作用。

这一结果不仅对金纳米粒子在基质表面组装成有序结构具有重要意义,对其它利用纳米粒子制成具有特殊功能的生物传感器具有一定的参考价值,并且建立了以具有生物相容性的电化学生物传感器测定血红蛋白的一种方法。

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