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2.1.4. 应用领域不断扩大：
美国酶制剂年产值6.25亿美元，食品工业占62%，拓展饲 料工业、洗涤剂工业、化学工业。
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2.2 酶的发酵技术
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2.2 酶的发酵技术
利用微生物产酶的优点是： (1) 微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。 (2) 微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。
从极端环境微生物和不可培养微生物筛选 新酶种
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嗜热微生物（Thermophiles 60-85 ℃， 超嗜热菌生长温度 85℃以上,105 ℃）。 嗜冷微生物（Psychrophiles -10～0 ℃ ）
嗜盐微生物(Halophiles, 含盐32%或5.2%)
嗜酸微生物(Acidophiles,pH2.5) 嗜碱微生物(Alkalophiles, pH 11) 嗜压微生物(Barophiles，1.01×105KPa, 4 ×107KPa)
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淀粉酶(包括α－淀粉酶、糖化酶、β－淀粉酶等)生产的 碳氮比一般比蛋白酶生产略高，例如枯草杆菌 TUD127α－淀粉酶生产采用由豆饼粉4 %、玉米粉8 %、 Na2HP04 0.8%、 (NH4)2SO4 0.4%、CaCl2 0.2%组 成的培养基。而在淀粉酶生产中糖化酶生产培养基的
LOGO 第二章 酶的发酵生产
酶源 酶可由动物（如胰蛋白酶、胃蛋白酶）、 植物（如木瓜蛋白酶）和微生物（细菌、 霉菌、酵母）产生，其中工业酶制剂大多 数由微生物发酵法生产。 由于微生物世代时间短，繁殖快、容易培 养和管理，可大规模工业化生产，所以工 业酶制剂大多由微生物发酵产生。
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产酶微生物的获得
NCIMB (National Collections of Industrial, food
and Marine Bacteria)
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（2） 从自然界中分离筛选
从与产生目的酶菌种可能相适应的生态环境中，采样分离
筛选。 1克土壤中含有 1×108 个微生物，自然界蕴藏着巨 境微生物，不可分离 微生物，绝对厌氧微生物等新的种质资源的研究开发。
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酶技术与应用课程
第2章 酶制剂的生产
江南大学生物工程学院 2012年2月 山东青岛
主要内容
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2.1 国内外酶制剂工业生产及应用现状 2.2 酶的发酵技术 2.3 酶的分离纯化 2.4 酶的剂型与保存
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2.1国内外酶制剂工业生产及应用现状
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2.1.1．新技术在生产中的应用
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免疫学检测方法 酶联免疫荧光测定技术， 96孔
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2.2.2 酶的发酵技术
2.2.2.1 培养基
培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料， 主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子 和产酶促进剂等。
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（1）碳源
碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏物质和生
产各种代谢产物的骨架，还是菌体生命活动的能量的主要 来源。
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（2）氮源
氮是生物体内各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、核苷
酸、核酸等的组成成分。
酶制剂生产中的氮源主要有有机氮源和无机氮源两种， 常用的有机氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋 白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；无机氮源有： (NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。
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杆菌 杆菌
红弧菌 红弧菌
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酵母菌
啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可产丙酮酸脱羧酶，醇 脱氢酶等。
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酵母的形态
红酵母的菌落
产酶微生物的分离筛选方法
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（1） 平板分离（选择性分离筛选平板） （2） 摇瓶逐个检测方法 培养基
细菌：营养肉汤琼脂培养基（pH 7.0，30-37℃） 霉 菌 ： 可 用 察 氏 、 土 豆 （ PDA ） 、 麦 汁 琼 脂 培 养 基 （pH5.5， 25~20℃，为了防止霉菌菌落蔓延连成一片，可 加入0.1%去氧胆酸钠、0.1%山梨糖等限制菌落扩散） 放线菌：高氏培养基、甘油精氨酸培养基等，pH6.8~7.0
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不可培养微生物
用PCR技术从土样中直接扩增DNA，能够 从不可培养的微生物中分离到DNA，并用 作克隆来源，可获得更多种类的酶。
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链霉菌（Streptomyces）
链霉菌是一种放线菌。菌落呈放射状，有分枝菌丝体，菌 丝直径0.2-1.2μm，G+。 菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，气生
猛加拉红（0.001%），不干扰霉菌的生长。
为了抑制酵母的生长，可添加放线菌酮（50mg/ml），不影 响细菌的生长。
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选择性培养基
用酸性或碱性培养基，可分离耐酸、耐碱微生物； 用添加了高浓度食盐培养基，可分离耐盐微生物； 用添加了高浓度盐或蔗糖的培养基，可分离耐高渗透压的
微生物；
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（3） 碳氮比 在微生物酶生产培养基中碳源与氮源的比例是。
一般蛋白酶 (包括酸性、中性和碱性蛋白酶) 生产采用 碳氮比低的培养基比较有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋 白酶生产采用由豆饼粉3.75 %、玉米粉0.625%、鱼粉 0.625%。NH4Cl 1%、CaCl2 0.5%、Na2HP04 0.2%、 豆饼石灰水解液10%组成的培养基；
津）；
美国杰能科公司（Genencor）→98年进入中国，
与无锡合资，控股80%（无锡，2005年杰能科国
际公司被丹尼斯克公司收购）；
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2.1.3. 品种、规模不断扩大
目前30多家600多个品种，应用于18个工业领域。
我国2000年酶制剂产量为30万吨，100家，市场份额仅占
5%，以未经除菌去渣的粗制品粉状酶为主。 国际以液体、颗粒为主。 国内糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大类占了97% 我国有7家上市公司介入酶制剂开发生产。
纤维素酶
培养基中的底物 检 测 方 法 LOGO 0.1%~0.5%可溶性淀粉 平板浇注稀碘液，可在 兰色背景显示出明亮的水解圈 干酪素 透明圈 果胶 平板浇注1%溴化十六烷基三甲 铵，未水解的果胶沉淀而形成白 色背景产生果胶酶的菌落周围出 现透明的水解圈 向长菌落的平板培养基上喷洒邻硝 基苯β-D-半乳糖（ONPG），由于 乳糖酶可分解ONPG 而游离出黄色 邻硝基苯，检出产酶菌。 0.3%普鲁兰糖 培养后浇注乙醇，产酶菌株可 产生水解圈 0.5%磷酸膨化纤维 产酶菌落周围形成水解圈
选择性培养基
酵母：用麦汁琼脂培养基（pH4.5~5.5）
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为了提高菌种分离效率，分离培养基中可添加一定数量的
药剂以抑制干扰微生物的生长。 如为了抑制霉菌的生长，可加入30~50U/ml 制霉菌素、克念 霉素、杀霉素等多烯类抗生素，不妨碍细菌的生长繁殖。 为了抑制细菌的生长，可添加青霉素（ 30U/ml ）、四环素、
(3) 微生物培养基来源广泛、价格便宜。
(4) 可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生 产可连续化、自动化，经济效益高。
(5) 可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选 育菌种、增加酶产率和开发新酶种。因此，下面将主 要介绍微生物发酵法产酶的一般原理和工艺。
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2.2.1 产酶微生物 菌种是发酵生产酶的重要条件。 菌种不仅与产酶种类、产量密切相关，而且与发 酵条件、工艺等关系密切。 已经在自然界中发现的酶有数千种，目前投入工 业发酵生产的酶约有50～60种。它们的生产菌种 十分广泛，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。
（1）从有关菌种保藏机构购买
如中国科学院微生物研究所CGMCC，日本大阪发酵研究所IFO ATCC (American Type Culture Collection)
DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell
Cultures)
JCM (Japan Collection of Microorganisms)
在高温下培养，可筛选耐热、耐高温微生物， 分离芽孢杆菌，可先将样品于80℃加热10-15min，可杀死 不产芽孢微生物后，再进行分离。
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为了提高工作效率，可设计一些肉眼可检测的方法， 如水解透明圈、变色圈等方法，鉴别出产酶菌落。
酶 α-淀粉酶 蛋白酶 果胶酶
乳糖酶
普鲁兰酶
三种方法：
组织提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶 微生物发酵：最大量的来源
化学及生物合成：生物重组
高新技术的应用：酶的修饰、固定化、基因 重组、膜分离技术、冷冻干燥
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2.1.2. 集中垄断，市场全球化： 规模企业由20世纪80年代初的80多家减少至20多 家，占市场90% 丹麦诺维信novozymes→1978年进入中国（天
根霉（Rhizopus） 毛霉（Mucor） 红曲霉（Monascus）
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根霉的形态
各种曲霉的菌落
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细菌
大肠杆菌（Escherichia coli） 芽孢杆菌（Bacillus）
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）蛋白酶
地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）高温α -淀粉酶
菌丝形成孢子链。
可产生葡萄糖异构酶，纤维素酶，碱性蛋白酶，中性蛋白 酶，几丁质酶，青霉素酰化酶等。
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放线菌的形态
放线菌的菌落
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霉菌
黑曲霉（Aspergillus niger） 米曲霉（Aspergillus oryzae） 青霉（Penicillium）