脂质体转染的实验原理与操作步骤大全
日期:2012-06-25 来源:互联网作者:青岚点击:3644次
摘要:
细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等, 本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
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细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
脂质体 (lipofectin regeant, LR 试剂是阳离子脂质体 N-[1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl]-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物 [1:1(w/w]。
它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ,是目前条件下最方便的转染方法之一。
转染率高,优于磷酸钙法,比它高
5~100倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。
用 LR 进行转染时, 首先需优化转染条件, 应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批 LR 都要做:第一,先要固定一个 DNA 的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间, DNA 可从1~5μg和孵育时间 6小时开始,按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确定出转染时间 (2~24小时。
因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24小时为宜。
细胞种类:COS-7、 BHK 、 NIH3T3、 Hela 和 Jurkat 等任何一种细胞均可作为受体细胞。
一、脂质体 (liposome转染方法原理
脂质体 (liposome转染方法原理:脂质体 ((Iiposome作为体内和体外输送载体的工具, 已经研究的十分广泛,用合成的阳离子脂类包裹 DNA ,同样可以通过融合而进人细胞。
使用脂质体将 DNA 带人不同类型的真核细胞 ,与其它方法相比,有较高的效率和较好的重复性。
中性脂质体是利用脂质膜包裹 DNA ,借助脂质膜将 DNA 导入细胞膜内。
带正电的阳离子脂质体, DNA 并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的 DNA 自动结合到带正电的脂质体上,形成 DNA-阳离子脂质体复合物,从而吸附到带负电的细胞膜表面,经过内吞被导入细胞。
二、脂质体转染操作步骤
1、操作步骤 [方法一 ]:
(1细胞培养:取 6孔培养板 (或用 35mm 培养皿 ,向每孔中加入 2mL 含 1~2×105个细胞培养液, 37℃ CO2培养至 40%~60%汇合时 (汇合过分,转染后不利筛选细胞。
(2 转染液制备:在聚苯乙稀管中制备以下两液 (为转染每一个孔细胞所用的量 A 液:用不含血清培养基稀释 1-10μg DNA, 终量100μL, B 液:用不含血清培养基稀释 2-50μgLR, 终量100μL,轻轻混合 A 、 B 液,室温中置 10-15分钟 ,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染 (如出现沉淀可能因 LR 或 DNA 浓度过高所致,应酌情减量。
(3转染准备:用 2mL 不含血清培养液漂洗两次,再加入 1mL 不含血清培养液。
(4转染:把 A/B复合物缓缓加入培养液中,摇匀, 37℃温箱置 6~24小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。
(5其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。
注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。
2、快速脂质体转染法操作步骤如下 [方法二 ]:
(1以 5×105细胞 /孔接种 6孔板 (或 35mm 培养皿培养 24小时,使其达到
50~60%板底面积。
(2在试管中配制 DNA/脂质体复合物方法如下:
①在 1mL 无血清 DMEM 中稀释 PSV2-neo 质粒 DNA 或供体 DNA 。
②旋转 1秒钟,再加入脂质体悬液,旋转。
③室温下放置 5~10分钟,使 DNA 结合在脂质体上。
(3弃去细胞中的旧液, 用 1mL 无血清 DMEM 洗细胞一次后弃去 ,向每孔中直接加入 1mL DNA/脂质体复合物, 37℃培养 3~5小时。
(4再于每孔中加入 20%FCS的 DMEM ,继续培养 14~24小时 ,
(5吸出 DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜 10%FCS的 DMEM , 2mL/孔,再培养 24~48小时。
(6用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。
3、稳定的脂质体转染方法如下:
(1接种细胞同前,细胞长至 50%板底面积可用于转染。
(2DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前 (2、 (3步骤。
(3在每孔中加入 1mL 、 20%FCS的 DMEM , 37℃培养 48小时。
(4吸出 DMEM , 用 G418选择培养液稀释细胞, 使细胞生长一定时间, 筛选转染克隆, 方法参照细胞克隆筛选法进行。
三、个人经验:
本人用的是 Invitrogen 公司的 Lipofectamine2000在 24孔板转染单层贴壁细
胞。
(别的方法可以参考生产商提供的 protocol
1、转染前 1天将 0.5~2×105细胞接种于 24孔培养板, 并加入 500ul 不含抗生
素的完全培养基,以保证转染时细胞汇合达 90~95%。
2、准备复合物
(1 将 0.8ug DNA稀释于 50ul 无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。
(2 将 2ul Lipofectamine2000稀释于 50ul 无血清无抗生素的培养液中, 轻轻浑匀, 室温孵育 5分。
注意:必须在 25分内进行。
(3 5分后将它们混合,并轻轻浑匀,室温孵育 20分。
3、吸去培养板的培养基,用 PBS 或无血清培养基 (最好清洗细胞 2次。
4、将复合物 (总体积 100ul 加入培养孔,前后摇动培养板使其分布均匀。
5、将细胞放入培养箱孵育 4~6h 后,可以更换含血清培养液去除复合物 (也可不用。
6、 24~48h 后可以观察转入基因表达情况。
7、稳定转染:换含血清培养基 24h 后将细胞以 1:10(或更高比例传代, 1天后更换筛选培养基筛选。
8、优化:要保证细胞汇合率达 90~95%(比较高 ;DNA/ Lipofectamine2000比率 1: 0.5~1:5,一般细胞 1:2~3.
脂质体转染法的主要优点是可用将 DNA 转染至悬浮或者铁壁细胞培养、转染效率相对较高、对基因片段大小的限制较小等,但是
阳离子脂质体对细胞的毒性相对较高,为了防止其毒性,要摸索好如下实验条件:脂质体与质粒的比例、细胞转染时间等。
脂质体是由脂双分子层组成的颗粒, 可介导基因穿过细胞膜。
通过脂质体介导比利用病毒转导进行基因转移具有以下明显的优势:①脂质体与基因的复合过程
比较容易; ②易于大量生产; ③脂质体是非病毒性载体, 与细胞膜融合将目的基因导入细胞后, 脂质即被降解, 无毒, 无免疫原性; ④DNA 或 RNA 可得到保护, 不被灭活或被核酸酶降解; ⑤脂质体携带的基因可能转运至特定部位; ⑥体外和体内试验都表明,接近染色体大小的 DNA 片段也能被转运至宿主基因组中并增
长;⑦转染过程方便易行,重现性好。
脂质体是具有双层膜的封闭式粒子,自身聚集性脂类分子包封内水相介质, 可分为大、小多层, 寡多层和单室脂质体,医学应用较多为小单室脂质体。
基于脂质体作为药物载体系统的经验,理想的用于转运基因的脂质体,对于质粒 DNA 具有高包封率 , 保护 DNA 不被血浆核酶降解的特点, 它们粒径分布范围窄, 粒径平均为 100 nm或者更小。
为使脂质体接近血管外区域,故采用具有广泛的结合潜力脂类,这种特殊脂类可促进与细胞膜融合和 /或提高脂质体在循环系统中的
稳定性。
第 1种为传统上的脂质体, 人们可控制其体外行为, 但不能控制其体内行为,它们很快被灭活或被固定;第 2种为无活性脂质体(即不与外界作用, 由于聚合物包封于表面的立体稳定性而抑制其相互作用; 第 3种脂质体表面结合抗原、凝集素或其他基团,由于表面结合的特定配基,也可特定地相互作用;第 4种为反应活性脂质体,如离子型、靶敏感型和融合性脂质体,这种脂质体有时指相转变的多孔脂质体, 脂质体内有离子敏感亚基, Ca2+ 其他金属离子敏感性脂质体, 也包括阳离子脂质体, 阴离子脂质体。
阴离子脂质体不属于有反应活性类,但特殊的试验如试管内与相反电荷(多离子相互作用例子除外。
常规脂质体进入细胞转运 DNA 实验, 其原理是脂质体增强细胞体的聚集, 即加速大分子、荷电多的分子透过膜,该过程相当复杂,尤其在包封较大片段时, 在实践中这种技术只在体外使用且要用融合剂,荷电越多用途越少。
脂质体可用于转基因, 或制备的药物, 利用脂质体可以和细胞膜融合的特点, 将药物送入细胞内部。