接种无菌操作步骤
3. 右手无名指、小指和手掌边夹住两试 管棉塞，轻轻拔出，试管口过火后移开， 仍靠近并面向火焰；
4. 将接种环伸入试管，稍冷后沾取少量 菌体。 5. 以下详见不同接种方法。
斜面接种技术
1. 用接种环经无菌操作从菌种斜面挑取少量 菌体； 2. 将接种环引入待接种的斜面，自下而上在 斜面上划一直线，再垂直于该直线连续划线； 3. 取出接种环，将试管口再次过火后塞上棉 塞，灼烧用过的接种环并放回原处； 4. 将棉塞塞紧，将斜面放入培养箱中培养。
平板活菌计数法步骤
0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml
菌悬液 10- 10- 10-
12
3
冷却至45 ℃左右
每皿约倒入15ml
沙保培养基
10- 10-5 10-6
40.5 ml 0.5 ml
0.5 ml
平板活菌计数法
待凝后倒置于28℃恒温培养48 hr后计数。 （选择菌落数在25～250个左右的平板计数）
3. 左手取一无菌培养皿，在火焰边稍稍打开 皿盖，倒入培养基15ml左右，放在桌面上 轻轻摇匀，待凝后即成平板；
琼脂平板划线分离法
4. 以无菌操作用接种环沾取待分离的混合 菌液；
5. 左手持培养皿底并使其面向火焰，依次轻 轻而迅速的一条条紧接着划线，划线距离 恰当（尽量靠近，但线与线勿碰到），划 过下面后不要回上去重复划；
实验菌种：大肠杆菌一支 酵母菌一支
斜面接种技术
斜面划线示意图
液体接种技术
1. 以无菌操作挑取少许菌体引入待接种的液 体培养基中，在接近液面处的试管壁上轻 轻摩擦，适当摇动，使之均匀分布在液体 中；
2. 塞紧棉塞后，放入恒温培养箱内培养。 实验菌种：大肠、酵母各一支
穿刺接种技术
1. 用接种针以无菌操作挑取少许菌体穿刺 与半固体培养基中间，刺至管底，再按 原途退出。穿刺时要做到手稳、动作轻 巧、快速；
其中N为每中格内菌数的平均值。
注数法
一、实验原理
微生物在固体培养基上形成的单 菌落，
一般认为是由一个细胞繁殖而来，及一 个菌
落代表一个细胞。计数时，将待测菌样 做一
系列稀释，再取一定稀释度一定量的稀 释液
接种到平板上，使其均匀分布。经培养
菌液浓度计算 菌液浓度（菌数/mL) = 菌落数×稀释倍数×2 注：只数浓度合适的两个平板取平均值
注意事项
1. 过程的无菌操作 2. 稀释分离法中熔化后的培养基倒平板前温度控制 3. 稀释法中用吸管取试管中液体的顺序从稀到浓 4. 取样前注意摇匀待测菌液 5. 取样时都要无菌操作。注意取菌液时移液管不要
实验内容： 微生物接种，分离和计数
远离酒精灯的情况下， 不得打开桌上的任何器皿
接种
接种技术是将微生物接到适于生长繁殖的 人工培养基或生物体内的过程。 接种方法：斜面接种、液体接种、半固 体穿刺接种等 接种工具：接种环、接种针、移液管和刮 铲等
接种必须在严格无菌的环境中进行！
接种方法
斜面接种技术：从已长好的菌种斜面上挑取 少量菌种移至另一新鲜斜面 培养基上；
液体接种技术：从菌种斜面上接入到液体培 养基中；
穿刺接种技术：用接种针从菌种斜面上挑取 少量菌体并竖直穿刺到半固 体培养基中；
接种无菌操作步骤
1. 将菌种斜面和待接种新鲜斜面夹在左手 的食指、中指和无名指之间，大拇指按在两 只试管中间。右手旋松棉塞，便于拔出；
2. 右手拿接种环，竖直伸入火焰中，环端 及伸入试管中部分均充分灭菌；
方法有琼脂平板划线分离、稀释分离、选择性 培养基分离、单细胞挑取、菌丝切割法等。
分离
琼脂平板划线分离法
稀释分离法 实验菌种：大肠、枯草、四联混合菌 菌液
琼脂平板划线分离法
1. 将熔化好的肉汤培养基，冷却至45℃左右； （触摸不烫手）。
2. 左手持盛培养基的三角瓶，在火焰附近， 用右手手掌边夹取棉塞，将三角瓶转移到 右手，瓶口过火；
2. 塞紧棉塞后，放入37℃恒温培养箱内培 养24小时观察结果。 实验菌种：四联、变形杆菌各一支
纯种培养
自然界中的微生物通过分离，使之在固体 培养基上成为一个菌落，便可获得纯种。
原理是将待分离的样品进行一定的稀释， 使之分散，在固体培养基上形成单个菌落， 再转接到适当的培养基上，我们一般就认为 是纯种。
2.无菌操作取混合菌液一环于Ⅰ中，摇匀；
3.同法自Ⅰ管至Ⅱ，自Ⅱ管至Ⅲ；
4.用1ml无菌吸管，分别从
管中吸
取0.2ml于三个无菌培养皿中，编号；
5.倒入熔化冷却至45℃左右的肉汤培养基Ⅲ15m、l左Ⅱ右，、轻Ⅰ轻摇匀，待凝
后倒置培养,24-48小时观察结果。
稀释分离示意图
一环
一环
一环
菌悬液
I
冷却至 45℃左右
每皿约倒入15ml
肉汤培养基
II
III
0.2ml 0.2ml
0.2ml
微生物的计数
血球计数法 平板活菌计数法 计繁殖数法只适宜于单细胞状态的微生物 或丝状微生物产生的孢子
血球计数法
一、实验原理
血球计数器是一特制的厚载玻片， 上面 刻有一定面积的方格，将盖玻片盖上后， 由 于两者之间存在着距离使之形成一定容 积的 小室。滴入待测样品后，使样品均匀充
血球计数法
二、血球计数器的构造
0.1mm 1/400mm2
盖玻片
25*1 6
计数室体积 =(1×1×0.1)m m3 = 10-4cm3
1mm
1mm
血球计数板
血球计数法
三、血球计数法的步骤
1、取待测啤酒酵母菌液，摇匀。并 做适 当稀释（以每个中格内20左右为宜）。
2、取洁净干燥的血球计数器，盖上 盖玻 片，用滴管吸取少量菌液沿盖玻片边 缘滴入
6. 盖上培养皿盖，倒置于37℃恒温培养箱中 培养24-48小时后观察结果；
琼脂平板划线分离法
每种划 一块
实验安排（两人一组）
斜面接种：两人1支 液体接种：两组1支（大肠） 平板划线分离：每人划两块平板
稀释分离法
1.取无菌生理盐水（NaCl0.85%)试管三支（每
支4.5ml)，编号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；
血球计数法
示范动作
血球计数法
3、先在低倍镜下找到计数室，注意光线不 能太亮，再转到高倍镜下，取5个中格进行 计数（每个中格取4个小格）。
计数时注意调节焦距，使不同焦距的菌 体都计入，在线上的菌，数上不数下，数 左不数右。
血球计数法
4、菌液浓度计算
菌液浓度 (菌数/mL) = N×25×104×稀 释倍数