实验五蛋白质的定量测定(凯氏定氮法、考马斯亮蓝法)
（4学时+ 4学时）
一、实验目的
学习凯氏定氮法测定总氮含量、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的方法。

通过检测添加三聚氰胺的样品的表观蛋白及实际蛋白质的含量，掌握两种方法定量检测蛋白质的原理及特点。

二、实验原理
食品制作需要检测蛋白质含量，但是直接测量蛋白质含量技术上比较复杂，成本比较高，不适合大范围推广，所以业界常常使用“凯氏定氮法（Kjeldahl method）”的方法，通过食品中氮原子的含量来间接推算蛋白质的含量。

也就是说，食品中氮原子含量越高，蛋白质含量就越高。

一种化工原料——三聚氰胺，因含氮量很高、生产工艺简单、成本很低，给了掺假、造假者极大的利益驱动，所以为了“增加”产品的表观蛋白质含量，出现了非法添加三聚氰胺的诸多案例。

A 凯氏定氮法总氮含量的测定：
凯氏定氮法是测量天然有机物（蛋白质、核酸、氨基酸等）含氮量的常用方法。

植物组织中的有机氮化物包括蛋白氮和非蛋白氮。

非蛋白氮主要是氨基酸和酰胺，以及少量无机氨化物，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。

可加入三氯乙酸，使其最终浓度为5％，将蛋白质沉淀出来，分别测定总氮、蛋白氮或非蛋白氮。

本实验对样品中总氮含量进行测定。

要测定有机物含氮量，通常是设法使其转变为无机氮后再进行测定。

将待测样品与浓硫酸共热，硫酸分解为二氧化硫、水和原子态氧，并将有机物氧化分解成二氧化碳和水；而其中的氮转变成氨，并进一步生成硫酸铵。

为了加速有机物质的分解，在消化时通常加入多种催化剂，如硫酸铜、硫酸钾和硒粉等。

消化完成后，加入过量的NaOH，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3导入过量的硼酸溶液中，再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。

滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算，可得出含氮量。

以甘氨酸为例，上述反应如下：
CH2NH2COOH + 3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3
2NH3 +H2SO4→（NH4）2SO4
（NH4）2SO4+ 2NaOH →Na2SO4 +2H2O +2NH3↑
2NH3 +4H3BO3→ （NH4）2B4O7 +5H2O
（NH4）2B4O7 +2HCl +5H2O →2NH4Cl +4H3BO3
试样中若含有硝态氮时，首先要使硝态氮还原为铵态氮，可加入水杨酸和硫代硫酸钠，使硝态氮与水杨酸在室温下作用生成硝基水杨酸，再用硫代硫酸钠（Na2S2O3）或Zn粉使硝基水杨酸转化为铵盐。

由于水杨酸与硫代硫酸钠会消耗一部分硫酸，所以消化时的硫酸用量要酌情增加。

B 考马斯亮蓝法蛋白质含量的测定：
考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式，红色和蓝色。

在非结合状态下为红色，当通过范德华力与蛋白质结合后，颜色会变为蓝色，最大吸收波长由465 nm变成595 nm。

吸光度的变化与蛋白质浓度的关系符合比尔定律。

蛋白质与染料的结合在2 min即可完成，达到最大光吸收。

1 h后，蛋白质-染料复合物发生聚合并沉淀。

考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质的灵敏度很高，标准测定法的灵敏度是Lowry蛋白测定法的4倍，其测定范围为10-100μg，微量法的测定范围为1-10μg。

标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲。

相比Lowry蛋白测定法，考马斯亮蓝法测定快速、简便，干扰物质少。

三、实验器材与试剂
A 凯氏定氮法总氮含量的测定
实验材料
牛血清白蛋白5.5mg、三聚氰胺1mg。

实验仪器
凯氏自动定氮仪，红外温控定时消化炉，玻璃消化管、三角瓶、酸式滴定管。

实验试剂
1. 浓硫酸（AR级）
2. 35%NaOH
3. 混合催化剂：K2SO4：CuSO4·5H2O＝3：1，充分研细、混匀，贮于广口瓶中备用。

4. 混合指示剂：取200mL 0.1%甲基红酒精溶液和50mL 0.1%甲烯蓝酒精溶液混合，贮于棕色瓶中备用。

本指示剂在pH＝
5.2时为紫红色，pH＝5.4时为暗灰或褐色，pH＝5.6时为绿色，变色点pH为5.4，变色范围为pH 5.2～5.6，非常灵敏。

5. 2%硼酸溶液：按100：1的体积比加入混合指示剂，摇匀后溶液呈紫红色即可。

6. 0.010 mol/L的标准盐酸溶液：取比重l.19的分析纯盐酸0.84 mL，加无氨蒸馏水稀释至1L，再以硼酸钠标定。

标定方法：精确称取四硼酸钠（Na2B4O7·10H2O）0.50 g，溶于50mL蒸馏水中，加混合指示剂2～3滴，用配好的盐酸溶液滴至浅红色。

精确计算盐酸的浓度并稀释成0.010mol/L。

B 考马斯亮蓝法蛋白质含量的测定
实验仪器
试管及试管架，移液管（0.1 mL ~5mL），分光光度计。

实验试剂
1. 考马斯亮蓝试剂
考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL95%乙醇中，加入100 mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL，滤纸过滤。

最终试剂中含有0.01%（W/V）考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）磷酸。

2. 标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量（可直接根据产品标定的蛋白质含量确定），根据其纯度用0.15 mol/L NaCl配制成0.1 mg/mL的蛋
白溶液。

1. 测试样品
样品1：同凯氏定氮法（牛血清白蛋白+三聚氰胺）：配制成0.05 mg/mL 的溶液。

（称量4.2308mg 牛血清白蛋白及0.7692mg 三聚氰胺，用0.15 mol/L NaCl 定容溶解至100mL ，供全班用，此与凯氏定氮法样品相同）
样品2： 牛血清白蛋白，0.05mg/mL 的蛋白溶液。

四、实验方法
A 凯氏定氮法总氮含量的测定
1．样品处理
准确称取待测样牛血清白蛋白5～10mg ，分别放入消化管中，准备1支空白消化管，然后给各管加入混合催化剂6g ，浓硫酸5～10 mL ，置红外消化炉上，先在150～200℃下加热0.5 h ，继续升温到400℃，再消化0.5～lh 。

直至溶液呈清亮透明。

待样品液冷凉后，可用自动定氮仪进行蒸馏，然后进行手动滴定。

2．样品测定
将35％的氢氧化钠溶液和配制好的硼酸溶液分别贮于固定的塑料桶中。

打开仪器的电源开关，通入冷却水以及供锅炉使用的无离子水，输入有关参数，放入已消化好的样品，即可自动蒸馏、手动滴定。

样品与空白蒸馏完毕后，一起进行滴定。

选用酸式滴定管，加入0.010 nmol ／L 标准盐酸溶液进行滴定，直至三角瓶中硼酸—指示剂混合液由绿色变回淡红色即为滴定终点，记录盐酸的用量。

3. 计算
含氮量：N （％）=()0401.1V V W M
-
粗蛋白含量： P (%)=N (%) × C
M ——标准酸摩尔浓度
W ——样品重量（克）
V 0——空白滴定标准酸消耗量（毫升）
V ——样品滴定标准酸消耗量（毫升）
C ——粗蛋白转换系数
B 考马斯亮蓝法蛋白质含量的测定
采用微量法测定。

1. 取12支试管，分两组按下表平行操作。

摇匀，1 h内以0号管为空白对照，595 nm比色。

2. 以标准蛋白含量为横坐标，吸光值为纵坐标制作标准曲线，或通过Microsoft Excel线性回归求方程。

3. 样品用0.15 mol/L NaCl配制成0.05 mg/mL的溶液，用吸管吸取0.5 mL 样品溶液，加入5 mL考马氏亮蓝试剂，以标准曲线制作中0号管作对照，测定OD值，平行做两份。

求平均OD值，代入上述回归的线性方程，根据样品稀释度求得蛋白质含量。

五、注意事项：
1. 样品及催化剂加入消化管时，避免粘于管壁。

2. 空白及样品滴定时，保证滴定终点的一致性。

3. 考马氏亮蓝染色后，比色应该在2min-1h内完成，在严格测定的情况下，可在加入试剂后5-20min内测定OD,在这段时间内颜色最稳定。

六、实验报告
1. 结果与讨论
2. 思考题
(1) 何为消化？如何判断消化终点？
(2) 凯氏定氮法、考马斯亮蓝法定量检测食品蛋白质的原理及特点。