2.2 基因突变及多态性的检测
将DNA芯片技术用于检测分子突变，能准确地确 定突变位点和突变类型，检测多个基因乃至整个基因 组的突变。Hacia等采用含有96000个寡核苷酸探针芯片 研究遗传性乳腺癌和卵巢癌易感基因BRCA1外显子11 位点可能发生的突变，结果在15例患者样品中检测到 14例患者存在不同的突变（包括点突变、插入、缺失 等突变），而在20个对照样品中均没出现假阳性，同 时还检测出了8个单核苷酸多态（SNP）。在多态性研 究方面，Kozal等应用基因芯片研究未曾接触蛋白质酶 抑制剂的HIV患者中HIV—lclade蛋白质酶多态，总共 分析了114例样本，发现蛋白质酶基因存在很大程度的 多态性，所示结果与sanger法检测结果一致性达98%。
DNA芯片技术的原理与应用
主要内容
DNA DNA
存
芯
在
芯
片
的
片
技
一
技
术
些
术
的
问
的
应
题
概
用
及
况
概
展
况
望
1 DNA芯片技术的一些概况
1.1 DNA芯片技术的概念和基本原理
DNA芯片也称DNA微阵列,是生物芯片 的一种。基因芯片原理最初是由核酸的 分子杂交衍生而来的,即应用已知序列的 核酸探针对未知序列的核酸序列进行杂 交检测
该方法优点是芯片制造速度快,成本低,而且芯片之 间制造误差小。其缺点是与原位合成法相比,构成 方阵的DNA片段需要先合成、纯化，以及在制造 DNA芯片前必须将如此大量具有微小差别的片段 分别保存,并且需要特制的自动点样装置。
点样法 即预先合成寡核苷酸，肽核苷酸或分 离得到cDNA，再通过点样机直接将其点到芯片上。 寡核苷酸或肽核苷酸的合成主要是通过多孔玻璃合 成法。肽核苷酸虽然在制备上比较复杂，但是它与 DNA探针相比，由于PNA（肽核酸）与DNA结合 的复合物更加稳定和特异，因而更加有利于单碱基 错配基因的检测。
1.2 DNA芯片分类
据不同分类标准,DNA芯片的分类如下: ❖ (1)根据固相支持物的不同,DNA芯片分为无机(玻璃、硅片、
陶瓷等)和有机(聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等)芯片。 ❖ (2)根据芯片上所用探针不同分为寡核苷酸芯片和cDNA 芯片。 ❖ (3)根据芯片点样方式不同,可分为原位合成芯片、微矩阵芯
采取样本 核酸提取
反转录
扩增放大
读取信息，诊断结果
样品标记
洗脱
杂交反应
2.4 在临床上的应用
2.4.1疾病诊断 人类的疾病与遗传基因密切相关，通过分析比较正常人 和病人的基因表达图谱的差异可以得出病变的基因信息， 大规模筛查出由基因突变引起的疾病，目前DNA芯片已 被广泛应用于癌症相关基因突变的快速检测。
分析：采用激光扫描或激光共聚焦显微镜采集杂交信 号（位置、强度、颜色），并与对照比较，经相关软 件进行图像和数据处理。即可得也待测样品的信息。 经以上获得的数据十分庞大，还需进行分析，比较， 归纳，才能得出明晰的结论。
DNA芯片的应用领域
科学研究
临床疾病诊断
药物研究开发
军事应用
法医学鉴定
健康管理
2.3 测序
通过与一组已知序列的寡核苷酸探针杂交，利用杂交 谱来重建待测DNA序列，该技术为大规模测序提供了 方便、快捷、准确的手段，同时也有助于了解基因表 达模式、基因突变和多态性，发现新基因以及克隆特 异性基因。利用固定的探针与生物样品的靶序列进行 分子杂交,得到特定的杂交图谱,进而分析出待测样品的 序列,称为杂交测序(Sequencing by hybridization, SBH)。 Chee等人用含135000个核苷酸探针（每个探针的长度 为25个核苷）的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体 基因序列，准确率达99%。
分离纯化：样品来源于活的细胞，使用一定方 法分离并纯化DNA或RNA（特别是mRNA）。 只有达到一定纯度的样品，才能保证后续操作 的正确。
样品的扩增：扩增的目的在于获得足够的 样品量。现已发展出固相PCR系统。
样品的标记：主要采用荧光标记法，也可 用生物素，或放射性核标记。标记的方式 采用PCR或RT-PCR。常用的荧光色素为 Cy3、Cy5。用Cy3、Cy5标记dNTP，经 PCR后，产物即可被标记。待测样品和对 照可采用双色荧光标记。
片(分喷点和针点)和电定位芯片3类。 ❖ (4)根据用途的不同分类为基因表达芯片和基因测序芯片。
1.3 DNA芯片的优点
作为新一代基因诊断技术，DNA芯片的突出特 点在于快速、高效、敏感、经济，平行化、自 动化等，与传统基因诊断技术相比，DNA芯片 技术具有明显的优势： （1）快速准确 （2） 检测效率高 （3）基因诊断的成本降低。 （4）自动化程度高 （5） 避免了交叉感染 （6）多功能 （7）高度的平行性
Moch等用532个肾癌组织标本构建了5184点cDNA表达 谱芯片，通过与正常肾组织进行比较，在癌细胞中筛选 出89条基因差异表达，其中有一条编码波形蛋白基因， 利用免疫组织化学技术对这条波形蛋白基因表达进行研 究，发现它与患者的预后呈显著的负相关，而与肿瘤的 分级和分期无关。
2.4.2 药物筛选
1.4 DNA芯片的制备过程
DNA芯片的制备
光蚀刻合成法 电压印刷法
DNA
点样法
芯 片
为了提高结果的准确性，来自血液或组织中的 样品的制备 DNA/mRNA样本须先行扩增，然后再被荧光素
技
或同位素标记成为探针。
术
的 步 骤
杂交 杂交条件的选择要根据芯片上核酸片段的长短及其 本身的用途来定。
激光共聚焦荧光检测系统 杂交图谱的检测和读出 CCD摄像原理 检测系统
质谱法
1.4.1 DNA芯片的制备
原位合成法(in situ synthesis) 借鉴半导体照相 平版印刷技术,在固相载体上原位合成寡核苷酸探 针序列。主要有光蚀刻法及压电印刷法。
光蚀刻法基本过程为:光有选择地照射到有光掩蔽 剂保护的玻璃片上,以去掉玻璃片上的光敏集团,激 活DNA合成过程,在去掉光敏集团的特定部位偶联 一个光保护碱基,再将第二个光掩蔽剂置于这个受 光保护的碱基上,如此不断地去保护和偶联,就可以 得到寡核苷酸片断,许多这样的不同序列的片段就 构成了DNA方阵。
原位合成(In Situ
Synthesis) 光定向合成寡核苷酸
Light directed oligonucleotide synthesis.
A solid support is derivatized with a covalent linker molecule terminated with a photolabile protecting group. Light is directed through a mask to deprotect and activate selected sites, and protected nucleotides couple to the activated sites. The process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each site.
1.4.3 分子杂交
芯片的杂交：将已知序列的DNA探 针显微固化于支持物表面，将已标记 好的样品与之进行杂交，杂交过程一 般在30分钟完成。
电子基因芯片：杂交速度更快。 采用肽核酸（peptide nucleic acid， PNA）探针可消除DNA二级结构的 影响。
1.4.4 遗传信息检测
原理：待测样品与支持物上探针列阵杂交后，荧光标 记的样品结合在芯片的特定位置，未结合的探针被除 去；样品与探针严格配对的杂交分子，热力学稳定性 高，产生的荧光信号强，不完全配对的，荧光信号弱； 不能杂交不产生荧光信号。
环境检测 食品检测 动植物检疫 运动医学
2 DNA芯片的应用概况
2.1 基因表达的分析与检测 将不同条件下某生物体中转录出的mRNA标记后与 代表它所有基因而制成的DNA芯片杂交,通过分析 杂交位点及其信号强弱,就可得出不同条件下各基 因的表达情况,还可鉴定出某些未知功能基因,发现 新基因,这一应用目前已成为DNA芯片研究中的一 个重点和热点。 DNA芯片具有高度的敏感性和特异性，可自动、 快速地同时检测成千上万个基因的表达，基因表 达的分析研究有利于揭示不同层次上多基因协同 作用的生命过程。
来自某一细胞的cDNA必须进行预处理，纯化， 扩增以及分类，然后再利用机械手把它们准确地固 定在基板的相应位置上，为了保证cDNA芯片检测 的准确性，在制备cDNA芯片以前必须提高低表达 基因cDNA的丰度，降低高表达基因cDNA的丰度。
1.4.2 样品的制备
样品的制备包括：样品的分离纯化，扩增，标 记
近的建立和应用,以及高通量自 动化药物筛选技术的出现,意味着大批量 的化合物可以在很短时间内快速地进行
压电印刷法的基本原理类似于目前采用 的喷墨打印机:打印头在方阵上移动,在方 阵每点上电流使喷头放大,并将装有机某 种碱基的试剂滴在晶片表面,然后固定,在 洗脱和去保护后另一轮寡核苷酸的延伸 就可以继续进行。压片印刷法由于不需 要与载体表面直接接触,故有很高的效率, 但制造工艺还不太成熟。

喷墨打印技术
Macroarray
Microarray
近7(2011.9前)年来公开发表的与基因芯片相关的学术论文
10000 9000 8000 7000
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