利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增
（1）3’ 锚定引物
利用mRNA的poly A尾巴设计
Oligo（ dTMN） ：Oligo（ dT） 引 物 的 3’ 端 加 两 个 核 苷 酸 （ 倒 数第二个不再是T）。
M：A、G or C N: A、G、T or C
5’
mRNA
3’
AAAAAAAAAAAAAAAA
这些引物由11~12个T及 两个其它的碱基组成，用 通 式 5’-T11MN 或 5’-T12MN 表示。
使用这种锚定引物， 可 以 将 整 个 mRNA 群 体 在 cDNA 水 平 上 ， 分 成 大 致 相等但序列结构不同的12 份亚群体。
（2）5’端的随机引物
同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性
一、化学合成目前常用的方法
磷酸二酯法、 亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、 固相合成法、
二、化学合成DNA片断的组装
1、互补延伸连接法
预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作
为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完
整的双链。
5’
3’
Klenow片段 引物
5’
3’
T4多核苷酸激酶 T4DNA连接酶
在测序胶上，每组扩出50-100条长度为 100-500bp的带。 引物组合：
12种锚定引物，若与20种随机引物，可 组成240组引物。
240组能分出20000多条带！
如 果 每 条 带 相 当 于 一 种 mRNA ， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的 mRNA。
（4）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较
本章重点掌握的分离方法及主要特点
5’
3’
2、互补连接法 （1）互补配对
预先设计合成的片断之间都有互 补区域，不同片断之间的互补区 域能形成有断点的完整双链。
（2）5’端磷酸化 （合成的DNA单链的5’端是-OH） T4多核苷酸激酶
（3）T4 DNA连接酶连接 完整的DNA双链
三、 化学合成的应用
1.全基因化学合成 （1）mRNA的含量很低，很难操作cDNA
相同引物对在不同来源cDNA中的PCR产物并排电泳
选择有差异的带，回收测序，得到部分cDNA序列。 再通过筛选等各种方法获得全长cDNA或基因。
优点：速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量 少等；
缺点：假阳性率高、获得的cDNA片段很短。
第五节 基因的化学合成
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的 设想，并于1979年在science上发表了率先成功地 合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。
（2）有些基因比较短，化学合成费用较低
2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成
合成带有定点突变的基因片断。
5. 合成人工接头或衔接物
含有各种酶切位点的人工接头（Adaptor） 或衔接物（Linker）序列。
EcoRI Adaptor EcoRI Linker
DNA合成仪
NM TTTTTTTT 3’
5’
12种锚定引物
3’ AG TTTTTTTT 5’ 3’ CG TTTTTTTT 5’ 3’ GG TTTTTTTT 5’ 3’ TG TTTTTTTT 5’ 3’ AA TTTTTTTT 5’ 3’ CA TTTTTTTT 5’ 3’ GA TTTTTTTT 5’ 3’ TA TTTTTTTT 5’ 3’ AC TTTTTTTT 5’ 3’ CC TTTTTTTT 5’ 3’ GC TTTTTTTT 5’ 3’ TC TTTTTTTT 5’
第四节 基因差异表达获得目的基因
差异显示PCR（DDRT-PCR）
DDRT-PCR：基于PCR的mRNA差异显示技术 在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或
细胞中发生的不同基因，按时间、空间进行有序的表达 方式，称为基因的差异表达。
真核基因总数约为100 000个，但在一定的发育阶段、 在某一类型细胞当中，则只有15%左右的基因得以表达， 产生出大约15 000种不同的mRNA分子。
的mRNA序列，在5’端又设计了20种10bp长的随机
引物。
5’
mRNA
3’
AAAAAAAAAAAAAAAA
NM 3’
TTTTTTTT
5’
RT
cDNA 3’
NM TTTTTTT 3’
cDNA第二链，并PCR
（3）用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增
实验结果：