基金项目:本研究由黑龙江省青年科学技术专项资金项目(QC06C047),黑龙江省教育厅项目(11513072),黑龙江大学青年科学基金(Q L200643),兽医生物技术国家重点实验室开放课题基金项目(NK LVB 2200501,NK LVB 2200601)资助;作者简介:车小琼,(1983-)女,四川绵阳人,在读硕士,主要进行天然高分子材料的研究。

知识介绍甲壳素和壳聚糖作为天然生物高分子材料的研究进展车小琼,孙庆申,赵　凯(黑龙江大学生命科学学院微生物黑龙江省高校重点实验室,黑龙江大学,哈尔滨　150080) 摘要:甲壳素是自然界中含量仅次于纤维素的天然高分子,壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后带有阳离子的多糖。

壳聚糖中的自由氨基以及它的高结晶性,使得它能溶于酸,而不溶于碱和绝大数的有机溶剂。

同时壳聚糖具有无毒性、无刺激性、良好的生物相容性、生物可溶解性,以及高的电荷密度,因而被作为一种新型的天然生物材料得到广泛应用。

文章介绍了甲壳素和壳聚糖的结构和性质,综述分析了甲壳素和壳聚糖在制备微球和作为支架材料中的应用,并总结了甲壳素和壳聚糖在这两个方面存在的问题和发展前景。

关键词:甲壳素;壳聚糖;微球;组织工程;支架甲壳素(chitin )又名甲壳质、几丁质,是一种广泛存在于昆虫、海洋无脊椎动物的外壳以及真菌细胞中的天然高分子化合物[1]。

壳聚糖(chitosan )是甲壳素脱乙酰基后的产物,具有良好的生物相容性和生物可降解性,因此可用作生物材料,甲壳素和壳聚糖具有来源广泛、取材方便等优点[2,3]。

1　甲壳素、壳聚糖的理化性质甲壳素是一种天然高分子化合物,其学名是β2(1→4)222乙酰胺基222脱氧2D 2葡萄糖,是由N 2乙酰胺基葡萄糖以及β21,4糖苷键缩合而成[4]。

如果把此结构中糖基上的N 2乙酰基大部分去掉的话,就成为甲壳素最为重要的脱乙酰化衍生物壳聚糖。

壳聚糖是由D 2氨基葡萄糖和适量的N 2乙酰2D 2氨基葡萄糖以2β(1,4)糖苷键连接而组成的。

其化学名是(1,4)222氨基222脱氧2β2D 2葡萄糖,结构类似于纤维素[1,2]。

111　甲壳素、壳聚糖的物理性质甲壳素呈灰白色或白色片状、半透明、略有珍珠光泽的无定性固体,相对分子量因原料和制备方法的差异而从数十万到数百万不等。

不溶于水、稀碱、稀酸及一般的有机溶剂,可溶于浓的盐酸、硫酸、硝酸等无机酸和大量的有机酸[1]。

壳聚糖是葡糖胺和N 2乙酰葡萄糖胺的复合物,由于聚合程度的不同其分子量在50～1000kDa 之间。

壳聚糖的外观呈半晶体状态,晶体化程度与去乙酰化相关。

50%去乙酰化时,其晶体化程度最低。

甲壳素和壳聚糖均具有非常复杂的螺旋结构,且甲壳素和壳聚糖的结构单元不是单胺(N 2乙酰胺基葡萄糖或者氨基葡萄糖),而是二胺。

112　甲壳素、壳聚糖的化学性质甲壳素和壳聚糖分子中含有—OH 基、—NH 2基、吡喃环、氧桥等功能基,因此在一定的条件可以发生生物降解、水解、烷基化、酰基化、缩合等化学反应[4]。

作为氨基多糖,壳聚糖(p K a =615)溶解性与pH 值紧密相关,在酸性条件下,由于氨基质子化而溶于水。

在pH<5时,壳聚糖完全溶于水形成十分粘稠的液体(其特性黏度受pH和离子强度的影响),经碱化处理后,可以形凝胶而沉淀。

壳聚糖是一种带正电荷的阳离子聚合物[3],在酸性水溶液中可与聚阴离子化合物如:肝素、海藻酸钠、梭甲基甲壳素等相互作用,形成聚电解质配合物。

壳聚糖分子链吡喃糖环C2上有氨基,C6上有羧基,因此能在较温和的条件下发生化学反应,制备出具有新特性的衍生物。

并且可以通过改造修饰其侧链基团而赋予性的化学衍生物以新的生物活性。

因为从自然界中获取的甲壳素脱乙酰化而得到的壳聚糖只溶于酸性环境中,使得它在体内的应用受到很大的限制。

现在我们可以通过在其分子上加上水溶性基团而使之溶于生理盐水中,从而减少酸性溶液对人体组织的刺激。

2　壳聚糖在微球制备中的应用壳聚糖(CS)是甲壳素的部分脱乙酰基产物,是自然界中唯一的碱性多糖。

作为甲壳素的脱乙酰化衍生物,CS有良好的生物相容性、生物可降解性、粘合性和无毒性,因而被广泛用于医学等领域[4～6]。

药物微球由于对特定器官和组织具有靶向性及对包敷在微球中的药物具有缓释和控释效应,因此载药微球的制备已经成为目前的研究热点。

而CS微球作为一种具有广泛应用前景的新型药物载体,除了具有亲水性能可以延长药物微球在体内循环的时间和减少巨噬细胞捕获,从而提高药物生物利用度以外;它还可以提高药物的包封率和载药量[6]。

根据CS微球应用目的的不同,可以用CS制成不同大小的微球。

现在,利用CS制备化疗药物、消炎药、胰岛素、抗生素等药物的缓释制剂已取得了良好的效果,并已用于临床。

壳聚糖微球的制备方法有乳化交联法、蒸发溶剂、喷雾干燥、液中干燥、沉淀/凝聚以及复凝聚法等。

复凝聚法是指利用两种聚合物在不同的pH值下电荷的变化,即一种带负电荷的胶体溶液与一种带正电荷的胶体溶液相混,由于异种电荷之间的相互作用形成聚电解质复合物而发生分离,沉积在囊芯周围而得到微胶囊。

海藻酸钠、聚丙基酸钠等高分子材料均能分别与壳聚糖起复凝聚作用。

目前,壳聚糖微球已经用于包封多种药物[7-13]、蛋白质(多肽)[14～18]、激素类物质[19]、氨基酸[20,21]等等。

慕容等[22]采用反相悬浮交联法合成了直径为100nm,粒度分布均匀,磁响应强,有吸附能力的,具有核壳结构的磁性壳聚糖纳米微球(magnetic chitosan nanoparticles,MC NP),考察了MC NP的吸附和释放药物的性能。

虽然壳聚糖具有一些良好的特性可用于载药微球的制备,但是在制备微球过程中,壳聚糖一般需要两次脱乙酰化反应。

由于制备条件的不同和原料来源的差异,分子量、脱乙酰化的程度波动较大。

此外,在制备微球时,壳聚糖须用酸溶液溶解,因此,制备水溶性的壳聚糖衍生物的技术有待进一步完善。

3　壳聚糖在组织工程中的应用甲壳素具有广泛的抗菌和止血、止痛的作用,同时具有选择性促进表皮细胞生长的独特的生物活性。

壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物,与细胞能够发生非特异性吸附,从而有利于细胞在其表面黏附。

因此,可以将壳聚糖作为良好的支架材料广泛的应用在组织工程学中[5]。

曾春[23]的研究证实,壳聚糖支架具有较高的孔隙率,并且孔隙相互连通,孔径较均匀,适于细胞的物质交换、生长代谢。

黄志海等[24]用冷冻诱导相分离的方法制备了壳聚糖—胶原多孔复合支架。

实验证明该支架具有很高的孔隙率和吸水率,在水中基本不溶胀,能够保持细胞支架的形态,满足作为组织工程支架的要求。

311　在皮肤组织工程中的应用壳聚糖的纤维刚性结构可以增强真皮基质的机械耐受力,延长创面细胞胶原酶对真皮基质的降解。

石研超等[25]以胶原和壳聚糖为原料制备了具有三维多孔结构的胶原—壳聚糖Π硅橡胶双层皮肤支架。

动物实验表明,该支架在原位诱导了真皮的再生,并有高达94%的移植成功率。

鲁元刚等[26]将具有真皮和表皮的复合壳聚糖人工皮肤移植到家兔的全层皮肤缺损处,创面愈合良好,无明显免疫排斥反应,2个月后表皮结构清楚,角质层较厚,真皮血管较多,无明显的炎性细胞,新生纤维明显增多。

结果表明,复合的人工皮肤动物体内修复实验的效果良好,可以考虑作为下一步临床实验的材料。

杨军等[27]利用自体表皮细胞和壳聚搪Π明胶膜能够构建出人表皮细胞膜片,应用于临床增殖性疤痕治疗6例,经过3月随访,创面愈合时间(1612±15)天,移植膜片存活良好,结构较完整,90天随访无明显疤痕增生,疗效肯定。

他们认为,壳聚糖Π明胶膜片对增殖性疤痕具有良好治疗效果,组织工程皮肤进人临床具有现实的可行性及广阔的应用前景。

312　在骨组织工程中的应用甲壳素作为骨组织工程支架材料的研究也有报道。

杨操等[28]取2周龄幼兔的长骨采集骨髓,培养骨髓间充质细胞,体外扩增1周后,分别种植于壳聚糖和壳聚糖Π明胶共混材料的表面。

在倒置光学显微镜、扫描电镜下观察细胞的粘附和生长情况,种植7天后用透射电镜观察细胞功能状况,用MTT方法检测种植后2天、4天、6天和8天细胞的增殖情况。

结果表明:壳聚糖Π明胶共混材料和壳聚糖单独使用都能促进骨髓间充质细胞在材料表面粘附并保持其在机体内的形态。

壳聚糖Π明胶共混材料表面的骨髓间充质细胞功能活跃。

在材料表面和培养板表面培养的骨髓间充质细胞均能持续增殖,壳聚糖Π明胶共混材料能显著促进骨髓间充质细胞的增殖(P<0101)。

他们认为壳聚糖Π明胶共混材料保持了壳聚糖的某些生物活性,同时由于加入明胶,能促进骨髓间充质细胞的增殖,可作为骨髓间充质细胞的载体应用于组织工程。

韩旭彤等[29]利用有机官能团对无机物矿化的调控作用,在壳聚糖多孔支架表而原位沉析轻基磷灰石(H Ap)。

研究结果表明壳聚糖分子结构中的氨基作为成核位点,在碱性条件下首先吸附Ca2+,再-等其它离子促使H Ap晶体在壳聚糖支架材料表面的成核、通过静电作用力吸附仿生溶液中的PO3-4、OH长大。

此类材料有望成为一种生物活性的肾组织工程材料。

Jiang等[30]制备了新的三维壳聚糖ΠP LAG A 多孔复合支架。

支架的压缩系数和压力强度都在骨小梁的范围之内,使得该多孔复合支架很适合应用于骨组织工程[31]。

赵营刚等[32]利用冷冻干燥法制备出用于骨和软骨组织工程的壳聚糖一明胶Π溶胶凝胶生物玻璃(CS2G elΠSG BG)仿生型复合多孔支架,并进行了孔隙率的测定和显微形貌的观察,探讨了各组分不同用量对(CS2G elΠSG BG)复合支架显微结构的影响以及复合支架在模拟生理体液中的仿生矿化性能。

研究表明,通过调节各组分的不同用量,可以制备出三维连通的复合多孔支架,且孔隙率达到90%以上;在模拟生理体液中浸泡后发现(CS2G elΠSG BG)支架表面有大量结晶态类骨碳酸羟基磷灰石生成,表明复合支架有良好的生物矿化性能。

313　在软骨组织工程中的应用有研究表明,转化生长因子2β(trans form growth factor2β)壳聚糖缓释微球具有良好的载药、释药性能,1微球支架可以较好的维持软骨细胞的表型,促进其粘附、增殖,作为软骨细胞的载体在组织工程软骨的构建及软骨损伤的修复中有良好的应用前景[33]。

史德海等[34]利用壳聚糖和Ⅱ型胶原成功的研制了三维多孔复合支架。

实验表明,壳聚糖可以作为支架载体应用于组织工程软骨的构建。

高海玲等[35]探讨了利用软骨细胞和新型生物材料壳聚糖动物体内构建软骨组织的可行性。

她们在体外分离培养猪耳软骨细胞,扩增后以510×107Πm L的终浓度接种于壳聚糖支架并植入猪皮下。

标本于8周后取材进行组织学及免疫组织化学等相关检测。