CHO Cell
CHO-K1
野生型宿主 细胞
CHO-S
GS基因表达系统 瑞士的Lonza公司
宿主细胞：CHO-K1SV 质粒：PEE12.4（Amp抗性，GS标记 基因，￥2000） 筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸）
DHFR基因表达系统 Life Technology公司
Freedom CHO-S Kit
宿主：CHO-S Cell （cGMP-banked） 培液：CD-FortiCHO Medium 限制性内切酶： AvrII/BstZ17I ，EcoRV /Pacl 线性化酶：NruI 转化：Neon® electroporation Transfection 筛选试剂：Puromycin/MTX 筛选方法：两轮加压筛选 单克隆筛选：有限稀释法
使用广泛的有BGH polyA site，转录 终止作用强于SV40.
表 达 盒
抗体基因表达盒的组织形式 已较为固定，但其中各元件 的选择仍有值得探讨的地方
PcDNA3.3/Poptiv ec载体系统
常用的较早的商业化载 体系统
适用于DHFR缺陷细胞， 但是有报道CHO （DHFR-)细胞，很难驯 化，生长也不好。
重组质粒Poptivec-target整合到宿 主菌染色体组上后的阳性菌可在不含 GHT的培养基中生长。
进一步用G418和MTX筛选，在MTX浓度 选择压力下，dhfr基因与其共转染的 目的基因一起扩增，提高目的蛋白表 达。
GS系统
瑞士的Lonza公司
Sigma、药明康德等公司都在自己 构建载体使用（只要知道载体的几 个原件可以自己全部合成）
CHO Classification
补充：
1980年CHO-K1经化学突变得到CHO-DXB11 （一个等位基因缺失）
1983年的电离辐射经诱变株CHO-DG44
（两个等位基因缺失）
由于CHO-DXB11 DHFR缺陷不彻底，很快被完全无DHFR活性
的CHO-DG44取代
注释：
ATCC （American Type Culture Collection） 美国菌种保藏中心 ECACC（ European Collection of Authenticated Cell Cultures） 欧洲细胞株/微生物保藏中心
CHO表达载体组成
原核基因序列
大肠杆菌复 制子及抗生 素抗性基因
在原核细胞 中大量扩增 和制备
真核基因序列
在哺乳动物中 有效的转录启 动子、增强子 元件、终止子 PolyA序列
在CHO细胞 中大量表达目 的蛋白
筛选标记
抗生素类筛 选标（Neo） 细胞代谢类 筛选标记 (MTX MSX)
筛选出稳定 表达较多抗 体的细胞株
核糖体进入位点
启动子下游有真核的 核糖体进入位点，通 常为GCCGCC A/GCCAUGG+4的 共有序列
IRES具有较强的起始 翻译的能力，研究发 现，某些动物的基因 前存在类似IRES的序 列，可以独立启动翻 译，并且翻译效率很 高，可称之为翻译型 增强子
转录终止信号和 PolyA加尾信号
影响mRNA的有效 合成和稳定性，提 高胞浆中能进行有 效翻译的 mRNA浓 度，提高表达水平。
CHO细胞表达抗体
基因工程抗体表达体系
酵母 细胞
昆虫 细胞
哺乳动物 细胞
CHO 细胞 骨髓瘤细胞
CHO（Chinese hamster ocary）
CHO细胞生物技术产业化的首选细胞系 目前70%以上的治疗性抗体蛋白都是由CHO细胞产生的 对蛋白质进行糖基化，其糖型与人类基本一致 不易传播人类病毒，比其他哺乳细胞基因组更容易进行改造和扩增 遗传背景清楚、转染效率高、可长期稳定传代并稳定表达有功能活性抗体 利于抗体纯化：非分泌型细胞，本身很少分泌内源性蛋白；可用无血清培养
整合位点 基因剂量 转录 翻译 加工组装 分泌 其他
相应策略
弱化选择标致基因；染色体定位筛选 弱化的可扩增选择标志基因 强启动子、增强子、强转录终止信号、适宜的抗体基因结构 翻译型增强子，适宜的抗体基因结构 轻重链表达平衡，宿主细胞修饰 适宜的抗体分泌前导肽，适宜的抗体基因结构 选择适宜的宿主细胞、宿主细胞修饰，尽量去除非生产性克隆
宿主细胞：CHO-s® Cells (cGMP-
banked) 质粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR标 记基因，￥10000） 筛选试剂：Puromycin/MTX（氨甲喋 呤）
抗体真核高效表达策略
作用环节
抗体mRNA的转录、转 录效率与mRNA的稳定 性是其中最重要的因素
因此，抗体的表达量很 大程度上由质粒载体的 各表达调控元件及组织 方式决定
GS系统
新近发展的更有效的 系统
具有更高的扩增效率， 但细胞长期连续培养 时，生长状况不佳。
DHFR系统
DHFR系统表达水平虽 较GS系统低，但细胞 生长稳定
PcDNA3.3/Poptivec载体系统
将右图质粒共转染CHO（DHFR-）
宿主菌须在含有GHT（甘氨酸、次黄 嘌呤、胸腺嘧啶）的培养基中生长
表达载体结构组成
骨架序列 选择性标志基因 表达盒 特殊的调控序列
选择标志基因
共扩增基因
（DFHR和GS）
当环境中存在高浓度 （MTX 、MSX）时，标记 基因可自发在染色体上扩 增拷贝数，连带其上下游 的序列一起扩增，共扩增 序列可达上千个bp，拷贝 数可增加几百到几千倍。
非扩增基因 （neo）
对目的基因的拷贝数 没有影响，如主要用 于构建瞬时表达载体。
启动子
启动子和相应的增强 子是最关键的元件 真核启动子含有TATA 盒（确定转录起始位 点）和下游富含GC的 序列（决定转录起始 频率）
常用的CHO细胞表达 启动子的转录活性依 次 为 CMV 启 动 子 > SV40 启动子> LTR启 动子
DG44
DHFR缺陷型 宿主细胞
DUXB11
PcDNA3.3/Poptivec 载体系统 Life Technology公司
宿主细胞：DG44 质粒：共转染PcDNA3.3（Neo抗 性基因，￥2000）和Poptivec （DHFR标记基因，￥3500） 筛选试剂：G418（遗传霉素）/MTX （氨甲喋呤）
宿主细胞：CHO-K1 质粒：PEE12.4 筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸）
1992年，Bebbington等首次使用GS基因细胞系统表达重组抗体
PEE12.4
PEE12.4 4 12.4
GS（谷氨酰Байду номын сангаас合成酶）筛选原理
L-谷氨酸+氨+ATP GS L-谷氨酰胺+ADP+Pi
DHFR系统