细胞周期检测（PI法）
一、实验方法原理
细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。

G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。

S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。

当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。

G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。

因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。

一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。

因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。

通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。

在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。

通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。

细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。

PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光
强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

细胞周期示意图如（图一）所示
（图一）
二、材料及准备工作
1.材料准备
试剂、耗材名称品牌货号
细胞培养瓶corning
6孔板corning
10ml离心管国产
1.5ml EP管国产
胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括
RNase-A 贝博试剂盒中包括
PI 贝博试剂盒中包括
无水乙醇国产
PBS 自配
2. 试剂配制
10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）
以1L量为例：
NaCl 80g
Na2HPO4·12H2O 32.3g
NaH2PO4·2H2O 4.5g
（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）
加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。

使用时用去离子水稀释成1XPBS
3.仪器设备
流式细胞仪；细胞培养孵箱；离心机；水浴；冰箱；离心管；封口膜；移液器
三、实验步骤及注意事项：（采用贝博公司的细胞周期检测试剂盒）
1.细胞样品的准备：
①单次流式细胞仪检测，1份样品细胞数量约106（我校8楼免疫教
研室的要求）
②收集细胞培养液备用。

③用胰酶（无EDTA）消化细胞，至细胞可以被轻轻用吹打下来时，
加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。

④将细胞悬液收集到10ml的离心管内。

800g左右离心5min，沉淀
细胞。

小心吸除上清，残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。

⑤加入1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞， 800g×5min。

为减少细胞
损失可用1.5ml离心。

⑥再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，残留约20ul左右的PBS，以避免吸走细胞。

重复第5步操作，用预冷的PBS再次洗细胞，并离心收集细胞。

轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团，用250ul预冷的PBS重悬细胞。

2. 细胞固定：
缓慢加入750ul冰浴预冷无水乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时或-20℃固定1小时，封口膜封口（此步可停止，-20℃保存样品，1周内样品检测不受影响）。

3. 染色：
①1000g左右离心3-5min，沉淀细胞。

小心吸除上清，可以残留约
50ul左右的70%乙醇，以避免吸走细胞。

③加入约1ml冰浴预冷的PBS，洗涤细胞一次。

再次离心沉淀细胞，
小心吸除上清。

④用200ul预冷的PBS重悬细
⑤加入Rnase A溶液20ul，37℃水浴30min。

⑥每管细胞样品中加入400ul碘化丙啶染色液，缓慢并充分混匀后
4℃避光孵育30 min。

染色完成后宜在24h内完成流式检测。

⑦. 流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红
色荧光，同时检测光散射情况。

采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

注意事项
1.RNaseA用PBS配制，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。

试剂
盒中带有配制好的酶。

2.流式分析时需要的是单个细胞悬液，因此在操作过程中充分混悬细
胞。

3.固定过程中不直接加70%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。

乙醇固定之后没有细胞沉淀。

3. PI液体4℃避光保存。

FlowJo分析细胞周期数据的过程
1.把细胞周期样品拖入FlowJo软件，双击打开原始数据。

如(图二)
所示：
(图二)
X轴选择FSC,Y轴选择SSC。

分析细胞周期的细胞选择上图所示的细胞群体进行分析。

2. 在SSC/FSC图中双击分析的细胞群体，如（图三）所示：
（图三）
X轴选择FL3-LIN,用来表示PI的线性信号。

Y轴选择FL3-PEAK,用来表示PI的峰值信号。

本实验数据采集采用的是贝克曼仪器采集的数据。

（如果是BD的仪器采集的数据，X轴选择FL2-W,用来表示PI
的宽度信号。

Y轴选择FL2-A,用来表示PI的面积信号），如上图所示多倍体或异倍体细胞不予分析。

3.在FlowJo工作台中选中“用于周期分析的二倍体细胞”这个结点，在工具栏的“工具”中选择“细胞周期”。

如（图四）所示
（图四）
说明：
1) 分析的模型有Watson和DJF两种，用户可以选择任意一种进行
分析，两模型间没有实质的差别。

模式右边是两种模型的显示方式。

2) 细胞周期拟合原则：G1峰限制和G2峰限制。

根据实验结果拟合
情况，对G1峰限制和G2峰限制进行适当的调整。

曲线调整原则：粉色的曲线为模型曲线，黑色的为样本曲线，理想状况是粉色和黑色曲线吻合一致为最佳。

拟和的好坏可以
●根据右边的RMS值来判断。

RMS(root mean square)值越小
越好。

但是这只是一个相对值，只在同样本不同模拟情况下，
选取最小值来达到最佳拟和。

你可以选中G1期的峰或G2
期的峰，根据调节按钮调节峰的宽度
●通常来说，G2的位置为G1的2倍。

你可以根据相对固定
的那个峰来确定另外一个峰的位置，如G1峰相对固定的话，
就选择G2峰的均数为G1的2倍(2G1)；如果G2峰相对固定
的话，就选择G1峰为G2峰的0.5G2细胞周期结果解读：
G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76
G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43
S期占25.73
G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）
峰的变异系数为4.54%（好）
细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。

总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，
在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）CV是变异系数。

一般CV越小，峰形越好，越尖锐。

能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。

细胞周期分析常用术语：
•CV：变异系数。

不同细胞群体DNA含量的细微差别可能有生物学上的重要意义，因此DNA含量的流式分析中分辨率尤其关
键。

通常检测分辨率或精度由G0/G1峰的CV来反映。

影响CV
的因素主要包括两方面：仪器因素和样品制备及染色过程对标
本的人为影响。

•Ploidy:倍体。

原指染色体数目。

流式中用来描述总的DNA含量。

二倍体细胞有正常细胞的DNA 含量但不排除染色体的异常。

S期含量 :S期细胞占总细胞周期的比例。

细胞周期数据结果输出
1. 细胞周期结果的输出根据最终的需求可以有多种输出方式
•在细胞周期分析窗口工具栏中选择“文件”并单击，选择下拉菜单中的“另存为”，选择保存位置、重新命名文件名以及文
件保存的文件类型（SVG、PNG、EMF、JPG）。

把上述样品的分析应用到组中，在Flow Jo软件界面中单击打开布局编辑器，在工作台的样品空间把“分析的细胞群体结点”拖入布局编辑器中，单击布局编辑器右上角的Batch工具。

输出整个实验组的数据。

如（图五）所示
（图五）。