基
因
工
程
题目：引物设计
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请根据以下EST序列设计引物
EST序列名称：BQ168698 GGGTACGGGCCCCCCTCGAGATAGGGCTCCTCCTCTGCGCCGCTAGCTCCTCCCCTTCT CTTACGTCTTCCAGCTAGCTCCTCCCCTTCTCTTACGTCTTCTCGTCCCCGTTCCTCTCA TCTCCCTGCCTGGGTTACCGCCGTCGCCCAGGTGAGTTGTTGCTGGGGGCGGGGCGGG GCGTGCTGGTGCCCTCGAGTTTGCCATTAAGGAAGCCGTAGGTGGAGGTGAGACGCTG CTGGAGTTCAAGGTGGCTGAACACCACGACGGGGCAACAGATCGGCAGCCTGTGGCC CGGACCTCAGGTCCAGTTCATGTTAA TTACCCAAAGCTTGGCGAGTTGTGGTGGTTAAT AA TTGCATTTGCTTTGA TGACACTAGA TCA TTAGTCACCGGATGTTAAGCTCGCTCTGTA GTGTTGCTTACAATATTTCCTCAATTTCCA TTGGTGGGAATTTTGAGTGAGAATGA TCCA CA TGATTGACAAGAACAGGGAATGATTAGCTTCAAGCACATAGCAAAGAATGTGAAAA TAATATATTTAACGTTGTATGGAGATGCAGTACTTGA TGCGGTCCTCTGGATCCGCTGCC CCTCTTTGTTTCTGA
引物长度20bp+4bp
选第10个引物
原因：没有hairpin 、dimer 、False priming ；GC%也没超过60%；Tm 相差不到1；产物也比较大；正反引物的3’端一个是C 一个是G 。

经过多次尝试，选前面分数高的引物在加酶切位点时，反而会导致产生各种问题（例如会形成发卡结构、引物二聚体等）的几率上升。

在正义引物的5’端加上EcoRI(GAATTC)酶切位点，再加上保护碱基GG。

同样，在反义引物的5’端加上EcoRI(GAATTC)酶切位点，再加上保护碱基GG。

因为正义引物含有发卡结构，要改动这几个碱基(TCG)，3’端的碱基不能轻易动，只能改动5’端。

因为TC是酶切位点上的序列，所以不能动，只能把G改成C。

结果形成很多False priming，因此要改动碱基序列。

原本序列5' TGGGAA TTCCGCTGAACACCACGAC 3'
改变序列5' TGGGAA TTCCGC A GA T CA G CA G GAC 3'
直接把T-A，C-G互换，不改变CG含量。

结果还是有False priming，再把
5' TGGGAATTCCGC A GA T CA G CA G GAC 3'换成
5' T CC GAATTCCGC A GA T CA G CA G GAC 3'
结果False priming没有了，但是又有了发卡结构，只能再修改碱基序列。

5' TCCGAATTC G GCAGA TCAGCAGGAC 3'
5' T G CGAATTC G GCAGATCAGCAGGAC 3'
结果如上图
最终引物序列为：
正义引物5' TGCGAA TTCGGCAGA TCAGCAGGAC 3'
反义引物5' CGGGAA TTCAGAGGACCGCATCAAG 3'
（GAATTC 为加入的酶切位点）
正反引物的Tm 值都在72℃左右，长度25bp ，GC 含量56%。

总结：设计引物过程中，发现许多问题，最麻烦的就是加入酶切位点会引起很多参数
（如Tm 值、GC 含量等）的改变，还会造hairpin 、False priming 等，而且每一次修改都可能造成新的hairpin 、False priming 。

经过多次尝试，发现改变碱基时，G-C 、A-T 互换可以不改变GC 含量，而且Tm 值得变化也不会太大；每三个碱基替换一个效果会比较好。