特异性位点的DNA甲基化的检测 BSP和MSP法
实验举例
通过BSP和MSP 方法对于前列腺癌 DLC-1基因启动子甲基化情况进 行检测。实验方法及结果： 1在线设计MSP引物 （/methprimer/index1.html） 2 DNA Extraction 3 DNA Bisulfite Treatment(Active Motif CO.,USA) 4 Bisulfite sequencing PCR 5 Methylation-Specific PCR
基因 APC
基因沉默对肿瘤的意义 对细胞增殖、迁移、粘附、骨架重组及染色质 稳定性失去调节作用
肿瘤类型 乳腺癌[17]、肺癌[18]、食管癌、结肠癌、胃癌、 胰、 肝癌
BRCA1
CDKN2A/p16 DAPK1
与DNA 修复与转录激活有关
周期素依赖性蛋白激酶抑制剂 钙/钙调素-依赖的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶; 凋亡 抑制
参考文献 1 W u C et al . Genes, Genetics, and Epigenetics: A Correspondence.Science, 2001, 293 (5532) : 1103-1105. 2 Wolff A P. Chromatin remodeling: why it is important in cancer.Oncogene, 2001, 20 (24) : 2988-2990. 3 Pennisi E. Behind the Scenes of Gene Expression.Science, 2001 , 293 (24) : 1064-1067. 4 Robertson KD. DNA methylation, methyltransferases, and cancer. Oncogene, 2001, 20 (24) : 3135-3155. 5 Holliday R. Mutation Res, 2001, 483 (Supp ll) : s3 6 周玉球.DNA甲基化分析技术的研究进展.国外医学遗传学分册 2001,24(6):303-308 7 Herman JG et al . Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands。Proc Natl A cad SciU SA , 1996, 93: 9821-9826. 8 Ahmad I, Rao DN. Chemistry and biology of DNA methyltransferases. Crit Rev Biochem MolBiol, 1996, 31: 361-380.
甲基化新位点的寻找
限制性标记基因组扫描（RLGS） 用甲基化敏感的稀频限制性内切酶NotⅠ消化基因组DNA，甲基化位 点保留，标记末端、切割、行一维电泳，随后再用更高频的甲基化 不敏感的内切酶切割，行二维电泳，这样甲基化的部分被切割开并 在电泳时显带，得到RLGS图谱与正常对照得出缺失条带即为甲基化 的可能部位
A
1
结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法
C
甲基化敏感性限制性内切酶PCR/Southern法
利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特 性(不需要亚硫酸氢盐，将DNA消化为不同大小的片段后 再进行分析。常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有 HpaⅡ-MspⅠ(识别序列CCGG)
Rapid analysis of CpG methylation patterns using RNase T1 cleavage and MALDI-TOF
甲基化的生物学作用
与基因C →T突变的关系 DNA 甲基化引起基因突变的机制主要是由于DMT催化反应形成。 DMT可以加快C(胞嘧啶) 和5mC 脱氨,封闭U(尿嘧啶) 的修复,并且 使U →T 改变,故DMT 促使CpG序列的C →T突变 抑癌基因p53就是一个典型的例证。50% 实体瘤病人出现p53基因 突变。突变中24% 是CpG 甲基化后脱氨引起的C→T 突变。 与基因沉默 的关系 基因的甲基化改变了基因的构型,影响DNA特异顺序与转录因子的 结合,使基因不能转录; 基因5′端调控序列甲基化后与核内甲基化CG序列结合蛋白 (methyl CG-binding p rotein)结合,阻止了转录因子与基因形成转 录复合物; DNA去甲基化为基因的表达创造了一个良好的染色质 环境，可活化基因表达 体外实验：体外转染诱导因子基因使皮肤成纤维细胞转变成iPS 细胞过程中，伴随载体编码转录因子的逐渐沉默(甲基化) 甲基化与肿瘤 抑癌基因的甲基化与细胞周期调控（如p16INK4a, p15INK4a, Rb, p14ARF)、 DNA修复(BRCA1, MGMT)、细胞凋亡(DAPK, TMS1)、抗药 性、分化、血管生成与转移等相关联
DNA甲基化研究
张茂雷 2009.5.23
主要内容
DNA甲基化原理 DNA甲基化的研究方法 甲基化的生物学作用 问题与展望
DNA甲基化原理
•
DNA 甲基化是指生物体在DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase ,DMT) 的催化下,以s-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 为甲基供体 ,将甲基转移到特定的碱基上的过 程。DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N -6位、胞嘧啶的N -4位、鸟嘌呤的N -7位 或胞嘧啶的C-5位等在哺乳动物DNA甲基化主要发生在基因启动子或第一外显子 中-CG-（-CpG-）二核苷酸中的C发生甲基化变成-mCGNH 2 N O N DNA甲基化酶 + CH3 HO O CCHCH2CHSCH 2
问题与展望
DNA的甲基化涉及基因的“开”与“关”，与细胞的生长繁殖、凋亡、 细胞的重编程及肿瘤细胞的形成密切相关。但对DNA甲基化还有许多问 题没有认识清楚： 怎样提高甲基化检测的灵敏与准确度？ 正常组织与肿瘤组织的甲基化精细“图谱”是怎样的？2003年启动 联合 基因 甲基化的选择性（基因组织特异性表达、管家基因的启动子抑甲基化） 甲基化的调控机理 高效的甲基化治疗方法
+
NH2 CH 3 N O N
+
A O HO O CCHCH2CHSCH2 NH2 O A
NH2
OH OH (SAM)
OH OH
DNA甲基化研究方法
基因组整体水平甲基化分析 特异性位点的DNA甲基化的检测 甲基化新位点的寻找
基因组整体水平Biblioteka 基化分析高效液相色谱柱（HPLC） SssI 甲基转移酶法 免疫化学法 氯乙醛法
在研究中，科学家运用限制性界标基因组扫描技术对6号染 色体区域进行 了扫描，发现了被甲基化的TCF21基因。这个 基因，由于在肿瘤细胞中被甲基化，因此表现出沉默状态。
甲基化的生物学作用
DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞 功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。
特异性位点的DNA甲基化的检测 -亚硫酸氢盐修饰
特异性位点的DNA甲基化的检测
直接测序法 Bisulfite sequencing PCR（BSP） 甲基化特异性的PCR（methylation-specific PCR, MSP） 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸 甲基化敏感性解链曲线分析 甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法 （不需亚硫酸氢盐修饰）
与胚胎发育： 胚胎发育过程中DNA甲基化动态 变化：精子和卵子是高度甲基化，受精后几个小时精子基因组发 生主动去甲基化, 卵子基因组在卵裂过程中依赖于 DNA 的复制被 动地、滞后地去甲基化, 在 8-细胞期甲基化水平降到最低点, 紧接 着在桑椹胚时又升高，女性两条XX染色体有一条是由于甲基化而 全部灭活 。DNA上的表观遗传(epigenetic)化学标记一生中都不断 变化，并且变化程度在家庭成员之间是相似的 。《美国医学协会 期刊》(JAMA) 2008.6.25 与体细胞重编程 密切相关 多能干细胞的提取物与体细胞共孵育实验 293T 细胞与多能细干 胞的提取物共孵育，可使其重编程，重新去分化为多能细胞 常家的多能细胞提取物羊胎素 的作用 与生物的记忆存储有密切关系 人对外界事物的记忆最终是储存到基因中而不是大脑皮层（2008年PANS)
乳腺癌[19]、卵巢癌[20]
GIT [21]、头与颈部瘤[22]、NHL[23]、肺癌 [21] 肺癌[24]
E-cadherin
ER GSTP1 hMLH1 MGMT P15 RASSF1A Rb VHL
增强增殖、侵袭与转移
激素抵抗 失去对致癌物活性代谢产物的解毒作用 缺损DNA错配修复,基因点突变 p53-相关基因，与DNA 修复及耐药性有关 细胞的过度激活与增殖 失去了对G1/S负调控抑制作用 不能抑制DNA复制和细胞分裂必需的基因转录 错误的降解RNA结合蛋白质，改变RNA稳定性
[43]
肾细胞癌[40]
缩写: APC, adenomatous polyposis coli; BRCA1, breast cancer 1; CDKN2A/p16, cyclin-dependent kinase 2A; DAPK1, death-associated protein kinase 1; ER, estrogen receptor; GSTP1, glutathione S-transferase Pi 1; hMLH1, Mut L homologue 1; MGMT, O-6 methylguanine-DNA methyltransferase; RASSF1A, Ras association domain family member 1; Rb, retinoblastoma; VHL, von HippelLindau; GIT, gastrointestinal tract; NHL, non-Hodgkin’s lymphoma.