土壤中放线菌的提取与分离环境科学与工程学院环工13实验班杨健3130206323【摘要】:放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。

因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。

大多数有发达的分枝菌丝。

菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。

可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。

放线菌[1] 是一群革兰氏阳性、含量( >55% ) 的细菌。

放线菌因菌落呈放线状而的得名。

它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。

与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。

从土壤中提取放线菌主要用高氏一号培养基进行培养。

【关键词】：原核微生物，高氏一号，革兰氏阳性，孢子等。

【Abstrat】：Actinomycetes is a kind of main assumes the hypha growth and to spore reproductive land was more powerful prokaryotes. Named after the deep in radiating growth on solid medium. Most have developed branch hyphae. Hyphae slender, width to rod-shaped bacteria, about 0.5 ~ 1 micron. Can be divided into: vegetative hyphae, also known as the substrate mycelium, main function is to absorb nutrients, some can produce different colors, is important basis of species identification; Aerial hyphae, fold, was born in the vegetative hyphae, also known as secondary hyphae. Actinomycetes [1] is a group of gram positive bacteria, content (> 55%). Actinomycetes by colony is put a line of its name. It is a prokaryotic organisms, is widely distributed in nature, mainly by spore reproduction, followed by rupture of reproduction. As the common bacteria, and more for saprophytic, a few stray. Extracted from the soil actinomycetes mainly use high's number one medium for culture.【Key words】: procaryote microbiology, coates, number one gram positive, spores, etc.引言放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。

放线菌只是形态上的分类，属于细菌界放线菌门。

土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。

本次实验所取的放线菌都来自于土壤,用高氏一号培养基进行对土壤放线菌的分离和培养。

一、高氏一号合成培养基的制备高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用）可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 •3H2O 0.5g，MgSO4•7H2O 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4 ，重铬酸钾50-75ug/ml(150ug/ml为宜)。

1、称量和溶化按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。

然后再称取其他各成分，并依次溶化，对微量成分FeSO4 ．7 H2 O可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后再加入。

待所有试剂完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的试剂中，在加热融化，最后补充所损失的水分。

2、调pH 用试纸测培养基的原始PH,如果偏酸，用滴管向培养基中加入1mol/LNaOH,边滴边搅拌，并随时用pH试纸测其pH,直至pH达7.6。

反之，用1mol/LHCI进行调节。

3、分装和加塞将配制的培养基分装入试管内，在试管口或锥形瓶口上塞上棉塞。

4、包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一根麻绳扎好。

用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

5、灭菌将上述培养基以1210C,20min,0.103MPa高压蒸汽灭菌。

6、搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至500C左右，将试管口端搁在玻璃棒上。

斜面的斜度要适当，使斜面的长度约为管长 1/3。

7、无菌检查将灭菌培养基放入370C的培养箱中培养24～28h，以检查灭菌是否彻底。

配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。

112℃灭菌20分钟。

二、土壤中放线菌的分离（1）待测样液的制备选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。

先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。

盛土的容器应是无菌的。

将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。

称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。

另取装有9ml无菌水的试管3支，编号10-3、10-4、10-5。

用无菌吸管无菌操作取10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，使与9ml水混匀，即为10-3浓度的土壤稀释液。

依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。

稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。

（2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌取2支1毫升移液管分别从10-5、10-4菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-5、10-4的培养皿内。

将温度为45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。

（4）平板划线法分离土壤中放线菌取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。

然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。

每组两个平板培养基。

将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。

在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许10-2浓度的土壤稀释液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。

划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。

不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。

（5）培养接种完毕，将平皿放入28℃恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。

（6）挑菌落待三种方法的平板长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。

如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。

转种至斜面，菌种用牛皮纸包好，置4℃冰箱中保存。

三、观察放线菌的菌落肉眼可见菌落，绘制菌落形态图，与标准放线菌菌落特征“干燥或较干燥，小而紧密，不透明，和培养基牢固结合，颜色多样，菌落正反面颜色一般不同”作比较。

四、放线菌的简单染色（1）涂片取干净的载玻片于实验台上，在正面边角做记号，并滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，灼烧接种环，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

（2）干燥干燥过程最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，也可以在微小火焰上方烘干。

烘干后再在火焰上方快速通过3~4次，使菌体完全固定在载玻片上。

不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。

（3）染色滴加草酸铵结晶紫染色液染色1~2min，染色液量以盖满菌膜为宜。

（4）水洗倾去染液。

斜置载玻片，用水冲去多余染液，直至流出的水呈无色为止。

（5）干燥用微热烘干或自然晾干。

（6）镜检按显微镜的操作步骤观察菌体形态，及时记录，并进行形态图的绘制。

五、观察放线菌个体形态严格按照光学显微镜的操作方法，依低倍、高倍及油镜的次序逐个观察放线菌.六、实验结果分析在分离土壤放线菌时，应为放线菌生长提供适宜环境，并且抑制其他菌落生长，即向培养基中加入抗生素和其他抑菌剂。

一般使用放线菌酮(50 mg/L)、海松素(50 mg/L)等抑制真菌。

但抑制细菌较困难，因为放线菌对一些抗菌素的反应与细菌相近，抑制剂重铬酸钾、青霉素对土壤真菌、细菌都有明显抑制作用，且不影响放线菌的正常生长，因此重铬酸钾、青霉素可作为选择性分离放线菌的抑制剂[11~12]，试验表明，重铬酸钾的适宜浓度为50 mg/L，而青霉素的适宜浓度为1 mg/L。

放线菌是革兰氏阳性菌，革兰氏染色后显蓝紫色。

由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色。

最后在显微镜下观察放线菌呈放线状，有大量菌丝。

参考文献[1]微生物实验指导高等教育出版社[2]环境工程微生物学第三版[3] 《放线菌分离培养基筛选及杂菌抑制方法研究》司美茹、薛泉宏[4] 《微生物教程》高等教育出版社周德庆[5] 《微生物学实验教程》高等教育出版社周德庆[6] 徐成勇,袁野,黎丹辉.选择性分离放线菌[J].无锡轻工大学学报. 1999(02)[7] 范丽霞,郑继平,杨先会.土样自然风干时间对放线菌分离的影响[J].海南医学院学报, 2010 (3)[8] 杨宇容.徐丽华.放线菌分离方法的研究[J]. 微生物学通报.1995(2)[9] 安荣.慕小倩等.土壤放线菌分离中抑制剂的应用研究[J].西北农业学报.2002（1）[10] 郑雅楠.杨宇等.土壤放线菌分离方法研究[J].安徽农业科学.2006(6)[11] 宗兆锋.郭小芳.诱捕分离土壤中的生防放线菌J].西北农林科技大学学报(自然科学版)2004(11)[12] 司美茹.薛泉宏.放线菌分离培养基筛选及杂菌抑制方法研究[J].微生物学通报2004(2)。