qPCR引物设计原则及具体操作步骤
1.找基因（DNA）
1)通过英文名称查找
通过查看文献或者百度搜索查找到对应基因的准确的英文名称
→进入NCBI官网
→点击网页右下角GenBank，进入GenBank界面
→在搜索框中输入准确的英文名称，点击Search搜索即可
2)通过序列号查找
通过查找文献，找到相应基因在GenBank上的登录号，直接输入上面的搜索框进行查找即可。

例如：犬冠状病毒(canine coronavirus，CCV)基因保守片段序列号为KT222978。

3)通过引物查找
通过查找文献，找到别人用过的对应的引物
→在NCBI官网右下角点击Primer-BLAST
→输入正、反向引物序列
→设置对应参数
→点击“Get Primers”进行搜索即可
4)找到对应的基因后点击“FASTA”，进入相应界面，再点击“Send to”选择相应格式，保存
序列。

2.qPCR引物和TaqMan探针的设计
1)引物设计注意事项
a)引物长度17bp-25bp为佳。

太短的引物容易导致扩增效率降低；太长的引物会导致出
现引物高级结构的几率增加。

两者都会干扰定量结果的准确性
b)扩增片段长度为：90-150 bp（最低不能超过70，最高不能超过180）
c)引物的Tm值为：最小57℃，最大63℃，最适为60℃，两条引物之间退火温度得差距
不超过1℃，推荐使用Primer Premier 5进行Tm值计算；
d)引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其
是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域。

e)引物设计时请尽量避开TC或者AG的连续结构。

f)3’端不能超过3个以上碱基互补，自互补碱基数不超过3；3’端最后一个碱基绝对不能
搭上
g)特异性要有保证，与非特异模板3’端互搭碱基数不超过3，不连续出现4个及以上的
GC互搭
h)引物3’端最后五个碱基不能包含超过2个以上的G或者C
i)引物的GC含量控制在40%-60%之间为好，最佳为45%-55%之间
j)正向或者反向引物应尽量接近探针序列但是不能和探针序列有重合区域
k)在Primer-BLAST设计时，在Organism 处选择相应物种
l)需跨外显子设计，避免基因组污染
2)TaqMan探针设计指南
a)探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但是不能与之有重合区域；一般相隔1~5个
碱基（一般10个以内，最好是1个碱基）。

b)应避免连续相同的碱基出现，特别是要避免GGGG或者更多的连续G出现。

c)探针5’端应避免使用碱基G，因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存
在淬灭作用
d)3’端应避免使用碱基A
e)如果序列中包含多态性位点，应使其位于探针序列中间。

f)保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。

理论上有一个碱基不配
对，就可能检测不出来。

若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。

且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。

且最好为A或T，而不能为G或A因为A、T为双键，而G、A为三键。

g)探针长度：Taqman探针的长度最好在25-32bp之间（一般为18-40bp），且Tm值在68-
72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃（至少要5℃），这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。

因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。

GC含量在40%-70%。

3)利用软件Primer Premier 5进行设计
打开软件，点击File→New→DNA Sequence→复制粘贴基因序列→点击Primer
→点击Search→设置对应参数（可调整）→点击OK
移动位置等），直至筛选出最优的正、反向引物。

在Primer-BLAST网页左上边框粘贴基因序列，设置相应参数，点击网页左下角的“Get
Primers”进行搜索即可。

（方便直接看到引物可能扩增的其他物种序列）
3.质量鉴定
1)利用软件PrimerSelect对引物和探针进行评估
打开软件PrimerSelect（在软件DNASTAR里面可以找到）→新建日志
→输入要进行比对的引物和探针序列→选择要比对的序列→点击Report即可输出相应的比对数据
（因为部分序列已经在Primer Premier 5比对过了，所以只要在此处比对正向探针和反向引物，或者反向探针和正向引物即可）
3’端尽量不要搭上
2)利用Primer-BLAST查看引物可能扩增的序列（重要！）
在Primer-BLAST网页输入设计好的正、反向引物序列→点击“Get Primers”进行搜索即可（若不止出现目的病毒序列，还出现了检测物种身上的其他病毒序列，则引物需要重新
设计）
4.引物和探针的合成
1)设计合成基因序列所需的引物
（若需要检测多个病毒，合成阳性模板，可将需要检测的病毒的扩增序列拼接在一起，最
好不超过500bp）
百度搜索DNAWorks，进入基因合成的网站
→填写名称（必须包含大写字母、小写字母和数字，不能加横杆或其他字符）
→填写网易邮箱
→选择相应的物种（做真核表达时需尤其注意，其他可根据需要进行选择）
→设置相应的参数
→粘贴需要合成的基因序列→点击“Design Oligos”，等待邮件（一般几分钟即可收到）
→打开收到的邮件，查看引物评分，评分尽量保证在“5”以下，越趋近于“0”越好
→复制粘贴引物序列，送往引物合成公司进行合成即可
2)合成引物
a)普通PCR引物用脱盐纯DSL即可
b)qPCP引物用PAGE纯，探针用HPLC纯
c)探针5’端荧光基团选择顺序“FAM→HEX→ROX, CY5”，3’端猝灭基团选择顺序“BHQ
→TAMRA→Eclipse”。