试剂准备（2）



Blocking solution :用Maleic acid buffer 10×稀释试剂6# （10×Blocking solution ），成1×的工作液，即每9ml Maleic acid buffer中加入1ml 10×Blocking solution 混匀， 现配现用。封闭膜上非特异性结合位点 Antibody solution(Ab) solution : 将4#试剂离心，按1： 5000或1：10000加入Blocking solution，2-8 º C可放12小 时。（每10ml Blocking solution 加1ul Ab抗体即可）.与 地高辛标记的探针结合。 Color-substrate solution（显色液）：从试剂 5#(NBT/BCIP)中取100ul到5ml Detection buffer，要避光， 现配现用。显示抗体结合的位点
随机引物标记
利用随机引物标记的方法将 Digoxigenin11-dUTP掺入到新合成的DNA 链中。 反应体系中包含六碱基随机引物、dNTP(含 有碱性条件下不稳定的Digoxigenin-11dUTP，Klenow 酶及反应所需的Buffer

DNA的地高辛标记和检测步骤
探针DNA 的标记及标记效率测定 DNA的转移和固定 杂交 免疫测定 洗去膜上探针再次杂交

将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl (原始浓度是5ng /μl)
Tube From tube# 1 2 3 4 5 6 7 8 9
DNA (µl) DNA Dilution Final dilution concentration buffer(μl) Diluted 1ng/µl orginal 1 2 2 3 4 5 6 2 15 5 5 5 5 5 0 198 35 45 45 45 45 45 50 1:100 1:3.3 1:10 1:10 1:10 1:10 1:10 10 pg/µl 3 pg/µl 1 pg/µl 0.3 pg/µl 0.1 pg/µl 0.03 pg/µl 0.01 pg/µl 0
探针标记效率检测

目的是确定杂交中使用正确的探针量，探 针用量太多会引起背景太深，用量太少则 无杂交或杂交很弱
检测流程
将地高辛标记好的探针系列稀释，点到一 条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120º C固定30分钟； 用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色 步骤显色； 比较显色结果，选择带有可以接受的背景 的最高探针浓度做正式的杂交。
Dig-High Prime DNA标记及检测试 剂盒理想条件下标记产量
Template DNA 10 ng 30 ng 1h 45 ng 130 ng 20 h 600 ng 1050 ng
100 ng
300 ng 1000 ng 3000 ng
270 ng
450 ng 850 ng 1350 ng
DIG-dUTP:dTTP的理想比例1：3 20-25bp 可插入一个DIG-dUTP 随机引物法标记的探针是基于模板的不同 区段、不同长度的DNA 片段 可以探测0.03-0.1pgDNA

标记步骤(20µl)

将10ng-1µg 模板DNA用无菌去离子水补足至16µ l。 沸水浴或干浴98 º 10分钟，使DNA变性成单链并 C 迅速冰浴冷却。 充分混匀DiG-high Primer （1#管），并取4 µ l至 变性DNA管，混匀并离心。 37 º C温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。 停止反应，加2 µ l 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 º C 加热10分钟。
本次实验标记步骤(10µl)

将300ng 模板DNA用无菌去离子水补足至8 µ l。 沸水浴或干浴98 º 10分钟，使DNA变性成单链 C 并迅速冰浴冷却。 充分混匀DiG-high Primer （1#管），并取2 µ l 至变性DNA管，混匀并离心。 37 º C温育1小时或过夜（最大到不超过20小 时）。 停止反应，65 º C加热10分钟。
杂交和杂交后洗膜时注意事项

使用正确的杂交温度（使用DIG EasyHyb，DNA：DNA37—
42º C，RNA：RNA 68º C，RNA：DNA 50º C）
为防止尼龙膜干燥，在准备好下一步处理用试剂 之前不要倒掉正在用的溶液 使用合适的探针浓度 探针用之前68º 变性 C 如果探针与靶DNA 的同源性低于80%，热洗时应 使用较低的温度（如60º C） 热洗之前应将洗膜液预热到热洗所需温度Biblioteka 电泳、转膜、预杂交注意事项

电泳时最好点上约5µl的地高辛标记的marker 电泳时DNA 的量不要过大，否则部分降解的DNA 片段就会与探针杂 交引起背景很深 电泳时不要将EB 加到凝胶或缓冲液中 变性和中和步骤中的处理30min可以分成2×15min 任何时候操作尼龙膜时都要戴着无尘手套用镊子接触膜的边缘 转膜时严防短路，不要让吸水纸全部湿透，重物根据膜的大小从 200g-500g 不等 面积较小的膜可直接放到胶上，如果尼龙膜较大，可以先在水中浸湿 再放入20×SSC平衡， 转膜后2×SSC 短暂漂洗尼龙膜以免杂交时有背景 预杂交及杂交时保证buffer覆盖膜 如果尼龙膜要多次探测，务必保证在任何时候都不要让尼龙膜干燥
地高辛标记的dUTP
地高辛标记系统的特点
标记和检测技术安全 标记的探针稳定可以保存一年 杂交液可以反复使用数次

与放射性同位素标记方法相同之处
标记和杂交技术相似 高灵敏度 低背景 可以标记DNA、RNA 或Oligonucleotides

与放射性同位素标记方法不同之处
无害,安全 产生的废物不需特殊处理 需要分析的时间短 探针稳定

操作基本要求
工作环境及试剂要干净：（1）试剂要高 压灭菌；（2）含有SDS 的试剂要过滤灭 菌；（3）TWEEN20应加到预先灭菌过的 试剂中 用具要干净：用之前一定要清洗得非常干 净 操作尼龙膜时要小心（1）戴无尘手套； （2）用干净的镊子夹取膜的边缘

探针模板DNA的要求




质粒DNA纯度要高。最好用高纯度的质粒DNA 分离和纯 化试剂盒纯化质粒模板或用苯酚/氯仿抽提去除残留的蛋 白质。纯化后的模板用H2O 溶解 用作探针模板的DNA应是线型的，大于100bp，如果模板 DNA >5kb则应用4碱基的限制性内切酶切割成较小片段 （切割后要纯化） 模板的量：10ng-3μg，如果要检测复杂基因组中的单拷贝 基因，标记模板的最低量要300ng（探针浓度：25ng/ml 杂交液） 如果做基因组DNA southern blotting, 应将克隆倒载体上 的DNA 酶切后琼脂糖电泳分离或PCR扩增，得到的片段 都需要用试剂盒纯化
探针的标记
地高辛标记系统
常用标记物分类

放射性同位素标记
非放射性标记 荧光素标记 生物素标记 地高辛标记


地高辛（DIG）是灵敏度高、非放射性核酸 标记检测体系。DIG检测灵敏度接近同位素 而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊 检测设备，相比生物素则没有样本内源干 扰之苦，很适合用于核酸非放标记检测。

地高辛标记与检测的原理


利用不同的方法将Digoxigenin-11-dUTP掺入到新 合成的探针DNA 或RNA链中或寡核苷酸的末端 探针与目标DNA杂交后，用连接有碱性磷酸酶或 其它偶联物的地高辛的抗体检测地高辛标记的探 针 根据地高辛抗体连接的偶合物不同，利用荧光检 测（anti-DIG-fluorescein，rhodamine)、化学发 光检测(anti-DIG-AP and CSPD or CPD-star)或显 色（anti-DIG-AP and NBT/BCIP or other substrates))的方法将探针杂交的位置显现出来
定量结果分析
染色至0.1pg的Control DNA出现斑点，比较 标记的探针与Control DNA 染色情况计算出 地高辛标记的DNA 的量。
如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想
如果0.1pg的对照显色，
0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg显 色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多 少探针（25ng探针/ml杂交液） 如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则 应重新标记探针
杂交液的准备和杂交温度的计算
DiG Easy Hyb：将64ml 无菌去离子水分两 部分倒入试剂7#瓶（DiG Easy Hyb Granules)，37 º C摇动溶解5分钟 计算杂交温度：通常为37 º -42 º C C Tm=49.82+0.41(%G+C)- (600/I)(I=length of hybrid in base pairs)。 Topt.=Tm-20 to 25 º C
1500 ng
2000 ng 2300 ng 2650 ng
探针定量

根据上表探针标记的理想产量将标记的探 针稀释到1ng/μl. 例如：起始模板用1µg，20μl体
系1h 后，查前表可知其理想标记量是850ng，则探针的理 想标记浓度为850ng/20 μl =42.5ng/μl; 则取1μl标记产物 +41.5μl H2O 混匀后即得到1ng/μl探针稀释液.

试剂准备（1）



Washing buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20. 15-25℃ stable. Removal of unbound antibody. Maleic acid buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20℃)0 15-25℃ stable. Dilution of Blocking solution. Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5(20℃). 15-25℃ stable. Ajustment of pH to 9.5. TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0. 15-25℃ stable. Stopping color reaction.