read)首先将DNA样 本进行片段化处理形成200-500bp的 片段，测序引物序列连接到DNA片 段的一端，然后末端加上接头，将 片段固定在flow cell上生成DNA簇， 上机测序单端读取序列。
2、Paired-end library

Pai点，在第 一轮测序完成后，去除 第一轮测序的模板链， 用对读测序模块(PairedEnd Module)引导互补 链在原位臵再生和扩增， 以达到第二轮测序所用 的模板量，进行第二轮 互补链的合成测序(图2)。

测序样本制备 的基本流程

样本核酸准备
预处理（片段化， 测序模板制备（单分子多拷贝） 上机测序 进一步处理测序模板
样本核酸的获取r-end Mate-pair DNA/mRNA/miRNA ChIP-Seq/MeDIP-Seq/转录组/表达谱等 等 ……

PCR Amplification
1、Fragment Library/single-read Library
3、HydroShear
The Hydroshear is used for fragmenting DNA to sizes larger than 1KB. The HydroShear offers the simplest, most reproducible, and most controllable method available for generating random DNA fragments. Virtually any source of DNA at any concentration in volumes as small as 40µ l can be randomly fractured to within a two-fold size distribution. For instance, if your target size is 2kb, you can calibrate the HydroShear to produce a distribution centered on 2kb with 90% of your DNA falling between 1.3 kb and 2.6kb
一、样本DNA等的片段化技术
1、超声破碎技术
不足之处： 体积大 易污染 精度不够

能量水平，时间，体积等参数
Covaris S-series

2010年1月5日报道——安捷伦科技公司(NYSE: A)与 Covaris 公司于今日宣布了签订一项合作开发市场协 议，该协议表明，未来Covaris S2 DNA剪切技术将 与安捷伦 SureSelect 靶向序列捕获系统一起销售，以 提高新一代测序实验的效率。
3、Mate-pair Libr段 包含基因组中较大跨度(2-10 kb)片段两端的序列，更具体 地说：首先将基因组DNA随 机打断到特定大小（2-10 kb范 围可选）；然后经末端修复， 生物素标记和环化等实验步骤 后，再把环化后的DNA分子 打断成400-600 bp的片段并通 过带有链亲和霉素的磁珠把那 些带有生物素标记的片段捕获。 这些捕获的片段再经末端修化
通常采用的DNA溶液体系为：1μg-５μg经纯化的基因组DNA溶解 于50 μL 的TE，并加入700 μL nebulization buffer。对DNA进行 雾化６分钟，气体压力为32--35psi（Pounds per square inch。P 是磅pound，S是平方square，I是英寸inch），雾化环境为冰浴。 所得的典型结果为DNA打碎至0–1200 bp，峰值为5–600 bp 雾化法与更早期的酶切法相比，可重复性相对较好，并且对于所处 理的DNA序列没有选择性，非常快速并且便宜。但是所得的DNA分 子片段长度的区间非常大，使得处于可用区间200 ± 20bp 的片段 仅占10%左右。为了满足新一代测序的要求，必须要选择长度较为集 中的片段，增加的纯化筛选造成了样本DNA的大量流失。这一缺点 不仅使成本增加，而且使得痕量DNA的研究难以实现，因而商业推 广价值较小。通量较低也是其显著缺点。目前已经基本被CovarisTM 超声仪进行超声打碎替代。

◦ AMPure Beads ◦ AMPure XP Beads

NEB next generation series
Agencourt AMPure XP Beads
SPRI works Fragment Library System

Beckman Coulter has created a simplified automated workflow that utilizes Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) paramagnetic bead based technology to create an automated system for fragment library preparation for the Illumina Genome Analyzer.

接头自连接问题？
Forked adaptor（illumina）

Single reads adaptor

Pair-end adaptor
连接酶
尼克酰胺单磷酸

DNA连接酶 RNA连接酶
DNA连接酶的作用机制
腺苷基
细菌的DNA连接酶以 NAD为能源，动物细胞 和噬菌体的连接酶以ATP 为能源。T4的DNA连接 酶可以连接平末端。

片段化方法比较
数字表达谱
二、Fragment Recovery（Size selection）
1、传统切胶回收
◦ ◦ ◦ ◦ 操作复杂 专门试剂盒 效率低 高效试剂盒开发？
2、改进型的凝胶回收(E-gel)




7分钟内完成DNA分离（50bp10kb） 选择琼脂糖浓度为0.8%、1.2%或 2%且结合有SYBR Safe或溴化乙 啶DNA染料的E-Gel 无需紫外线即可实时显示DNA迁移， 灵敏度超高 快捷简单的DNA条带提取 适合低、中、高不同通量

测序模板制备
◦ 乳液PCR ◦ 桥式PCR ◦ 滚环扩增
的质控标准
DNA: 完整性 Total RNA: 完整性（Agilent） miRNA Pretreatment 某测序公司原始样本需求
1. 所需处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明。 2. 如提供实验材料为动物组织材料，样品质量需大于2g； 3. 如提供实验材料为植物样品，样品质量需大于4g； 4. 如提供实验材料为培养细胞，请提供1×107培养好的细胞； 5. 如提供实验材料为血液样品，请提供≥2ml的样品。
6、Target Capture Sequencing / Selection library
Molecular Inversion Probe （MIP）
靶标富集
为了在大样本量中充分发挥新一代测序技 术的潜能，科学家们开发出几种方法，来 选择性富集目标区域。与全基因组测序相 比，富集后再测序降低了成本，也减轻了 后续数据分析的压力，让研究人员能够轻 松利用新一代测序的通量。目前有几种靶 向富集方法，包括分子倒臵探针连接测序 （MIPS）、基于寡核苷酸杂交 三种富集技术：罗氏NimbleGen的 SeqCap寡核苷酸杂交型芯片捕获，安捷 伦的SureSelect寡核苷酸杂交溶液型捕获 以及Raindance的多重PCR方法的方法。

HydroShear
HydroShear
我们的结果
可以实 现自动 清洗的 新设备
4、雾化法（Nebulization）

DNA雾化仪的工作原理如下： 高压氮气从顶端压入，通过两 侧的进气道对底部的DNA缓冲 液混合物产生压力，液体顺着 中部细管上升至顶部。顶部出 液口处有筛子之类的东西， DNA通过“筛子”，被打成小 片段。通过调节压力大小，可 以把DNA打成所需要的bp长度。 在使用之前DNA必须经过纯化。
3、新的仪器设备
Caliper的Labchip XT全自动DNA片段 回收仪等 前期投入大 耗材昂贵 回收载量低
4、新的试剂 —bead-based size selection
磁珠法纯化试剂：可以进行某特定片段区域的选择
E-Z 96® Mag-Bind® Oligonucleotide Purification Kit Agencourt Bioscience
Fragmentase（NEB）
Generates dsDNA breaks in a time-dependent manner to yield 100–800 bp DNA fragments depending on reaction time.

损失相对较小 集中程度不高，需要后续的片段选择
Covaris Adaptive Focused Acoustics™ (AFA)

浓度不同

长度不同

物种不同
一些比较理想的结果
体会： 有很大的损失 不同的样本需要不同的优化，没有现成可直接用的条件
2、片段化酶


最初是利用限制性内切酶（Endodeoxyribonuclease）或DNA 酶I（Deoxyribonuclease I）配合Mn2+将DNA大片段切割成小 片段 针对新一代的高通量测序平台，已经有多家公司开发了配套的酶 切试剂，多数是利用几种酶组合而成，其中包含一种可以在双链 DNA上有随机识别位点的酶将双链DNA制造切口，然后由另外一 种酶将切口处的单链DNA切断形成双链DNA片段 Fragmentase：该片段化酶产品包含着两种不同功能的酶，其一 可以实现在DNA双链分子上随机制造切口（nick），另一种酶可 以识别这种切口并且在互补链对应处制造缺口，从而完全从该处 断开双链DNA，从而实现只需根据反应时间的长短获得不同长度 的DNA片段，范围为100–800 bp DNA。不同的处理反应时间 获得的长度有所差异，但是这种处理方法对原始样品的需求较大， 而且对于目前主流的二代测序技术而言，还需要进一步切胶选择 特定的片段，而且该商品对于不同样品的反应效果均一性有待进 一步验证