标本包装、运送
（三）实验室检测
实验室检测的生物安全要求
实验室病原学和血清学检测相关活动严格按照 《人间传染的病原微生物名录》的要求，在相应 的生物安全级别实验室开展。 病毒培养在BSL-4实验室 动物感染实验在ABSL-4实验室 未经培养的感染材料的操作在BSL-3实验室 灭活材料的操作在BSL-2实验室 无感染性材料的操作在BSL-1实验室中进行
核酸检测流程图
反应体系混合物
正、反向引物混合物 20 µ l
合适的PCR管
特异性荧光探针
PCR仪
5µ l 反应条件取决于 病原体特异性
1) 核酸分离，BSL-3
2) Real-time PCR 检测
实时定量RT-PCR方法
引物/探针
引物探针1 ZEBOV-F ZEBOV-R ZEBOV-P 引物探针2 EBOGP1D-fwd EBOGP1D-rev EBOGP1DZ-Prb
实验人员个人防护
口罩、帽子、防渗漏防护服、乳胶手套、高筒鞋套、防护面 罩（正压头盔）等；
注：手套、防护服大小要合适，检查有无破漏；手套的量要充足，满足随时更换。
所有涉及感染性材料的操作均应在BSL-3实验室二级生物安全 柜内进行； 方便取用的消毒剂（0.5%次氯酸钠溶液、75%酒精等），空间 喷雾消毒设备（使用过氧乙酸，过氧化氢等）。
核酸检测
发病后3天内，血标本中埃博拉病毒核酸检出率低， 检测阴性不能排除埃博拉病毒感染，应结合病例 的流行病学史和临床表现进行综合判断
发病后3～10天血标本病毒核酸检出率高，检测阴 性可排除埃博拉病毒感染。
酶标检测
病毒抗原检测：用酶联免疫法检测埃博拉病毒核 蛋白抗原。病毒抗原检测阳性可确诊。
序列
CGCCGAGTCTCACTGAATCTG AGTTGGCAAATTTCTTCAAGATTGT FAM-CGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTATCAAGTAA-BHQ1
TGGGCTGAAAAYTGCTACAATC CTTTGTGMACATASCGGCAC FAM-CTACCAGCAGCGCCAGACGG-BHQ1
实验操作的生物安全要求
核酸提取时，加入核酸提取裂解液后，可在BSL-2及 以上实验室进行。血清学检测时，应先60℃1小时灭活 ，灭活材料免疫学检测应在生物安全3级（BSL-3）实验 室内进行
在进行感染性材料操作时，每次标本份数不宜过多， 每份标本量不宜过大
核酸检测
是目前早期诊断、早期发现埃博拉出血热病例的 主要检测方法 采用荧光定量 PCR 进行病毒核酸检测，患者标本 中扩增到特异性核酸，可确诊埃博拉病毒感染 传统RT-PCR因易出现污染使用受限，但可以获得 病毒基因序列
序列
大小
Filo-A2
Filo-B2
GTCAAAGCATTTCCTAGCAACATGATGG
ATAATAATCACTCACATGCATATAACA
结果判断：阳性结果可以初步判断埃博拉病毒感染，但一 般情况下需经序列分析确诊。
谢 谢！
血清特异性IgM抗体：采用捕获法ELISA方法检测。 疑似病例具有疫区旅行史或患者接触史，IgM抗体 阳性，可确诊，阴性不排除埃博拉病毒感染。 血清特异性IgG抗体：目前主要采用间接法ELISA 或免疫荧光方法检测IgG抗体。单份血清埃博拉病 毒IgG抗体阳性为曾感染埃博拉病毒，双份血清埃 博拉病毒IgG抗体阳转或恢复期滴度较急性期4倍 或者以上增高者，可确诊，阴性不排除埃博拉病 毒感染。
埃博拉出血热病毒实验室检测
实验室检测
（1）病毒抗原阳性 （2）血清特异性IgM抗体阳性 （3）恢复期血清特异性IgG抗体滴度比急性期有4倍以上升高 （4）从患者标本中检出埃博拉病毒RNA （5）从患者标本中分离到埃博拉病毒
诊断
疑似病例基础上具备诊断依据中实验室检查任一项检测阳性 者
检测内容
一次性工作帽 一次性防渗漏防护服 防水靴（或者密闭式、防穿刺防水的鞋加穿一次性鞋套） 防护眼罩或防护面屏 医用防护口罩（N95及以上）或全面型自吸过滤式呼吸器 双层一次性乳胶手套
标本采集人员的防护
穿戴顺序：
步骤1：手卫生 步骤2：一次性工作帽（如需要） 步骤3：医用防护口罩（N95及以上）或全面型自吸过滤式呼 吸器 步骤4：防护眼罩或防护面屏，如选择全面型自吸过滤式呼 吸器时无需佩戴 步骤5：里层一次性乳胶手套 步骤6：一次性防渗漏防护服（必要时，可加穿防水围裙） 步骤7：外层一次性乳胶手套 步骤8：防水靴或防水靴套（或者密闭式、防穿刺防水的鞋 加穿一次性鞋套）
RNA模板5µl，酶（25x）1µl，缓冲液12.5µl，引物（10uM）各1µl，探针 （10uM）0.5µl，加水至总体积25µl。
推荐反应条件为50℃30min，95℃10min，95℃15s、60℃45s反应40个循环 。
结果判断：以定量荧光PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为本底信号， 以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈 值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值），以Ct<35荧光信号数据线性化处理后 对应循环数生成的曲线图成“S”形的标本，可判断为相应的埃博拉病毒核酸检 测阳性。
（二）标本包装与运送
标本包装、运送
按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒） 种或样本运输管理规定》要求运输至具有从事埃博 拉病毒相关实验活动资质的实验室
标本应当置于符合国际民航组织规定的A类包装 运输材料之中 低温冷藏运输，避免反复冻融
标本包装、运送
A类包装，符合UN2814要求，按照三重包装系 统包装：第一层包装（可密封样本袋、50mL离心 管等）；第二层安全壳容器（防水、防漏）；外 层运输包装组成 样本袋放入防水防漏的第二层安全壳容器中， 为降低破碎或泄漏的风险，用吸水纸等填充物固 定标本袋。安全壳容器和外包装之间放冰袋 不要打开采集管或分装样本 不要离心分离血清
埃博拉出血热病毒的样本采集、 运送和实验室检测
浙江省CDC 卢亦愚 2014年8月
主要内容
标本采集 标本包装与运送 实验室检测
（一）标本采集
标本采集人员的防护
按照2014年8月19日发布的《中国疾病预防控制中 心关于埃博拉出血热个人防护技术方案指南（第一 版）（试行）》的要求，采样人员应穿戴防护用品 包括:
标本采集人员的防护
脱摘顺序：
步骤1：外层一次性乳胶手套 步骤2：防水靴或防水靴套（或者密闭式、防穿刺防水的鞋 加穿一次性鞋套） 步骤3：内层手套消毒 步骤4：一次性防渗漏防护服（需要时，先脱防水围裙） 步骤5：内层手套消毒 步骤6：防护眼罩或防护面屏 步骤7：医用防护口罩（N95及以上）或全面型自吸过滤式呼 吸器 步骤8：一次性工作帽（如需要） 步骤9：里层一次性乳胶手套 步骤10：手卫生
标本采集
按照《埃博拉出血热防控方案（第二版）》 规定，定点医院负责病例的标本采集工作
根据流行病学史、症状等判别结果，采集留 观病例、疑似病例和确诊病例的标本 目前仅需采集血液标本，大小便、唾液和组 织也可用于检测
标本采集
用分离胶无菌真空促凝管采集静脉血，每管 3mL，标记后4℃保存，填写标本采集登记表 留观病例、疑似病例采集4管，其中2管尽快 送省疾控中心实验室，2管保存于样本采集单位， 待排除埃博拉病毒感染后用于其它病原体的筛 查
ZEBOV
y=-3.540x+39.69 R2=1.00西非流行株一致； 1套采用兼并引物，与目前西非流行株差 别2个碱基，但理论上不影响检测。
常规RT-PCR方法
引物
方法1 EBVGP451-472 F EBVGP 1024-1003R 方法2 Filo-A1 Filo-B1 ATCGGAATTTTTCTTTCTCATT ATGTGGTGGGTTATAATAATCACTGACATG 414bp 282bp 5’-TGGGCTGAAAACTGCTACAATC-3’ 5’-TTTTAGTTTCCCAGAAGGCCCA-3’ 570bp
目前省疾控中心实验室报送审批的检测项目包括：
埃博拉病毒核酸检测 抗埃博拉病毒IgM、IgG抗体检测
标本处理与保存
省疾控中心在BSL-3实验室尽快分离血清，离 心时使用有密封盖的离心桶或转头进行标本离心， 应在生物安全柜内打开离心转头放入或取出装有 标本的离心管
分离的血清标本长期保存应置于-70℃以下， 保存不超过1周可置-20℃
2套实时定量PCR检测方法检出限50～100拷贝
ZEBOV
y=-3.469x+39.75 R2=0.999
SEBOV
y=-3.533x+38.41 R2=1.000
CEBOV
y=-3.478x+38.87 R2=0.999
BEBOV
y =-3.470x+38.75 R2=1.000
REBOV
y=- 3.509x+38.54 R2=0.999