无菌检查和微生物限度检查操作规范（中国药品生物制品检定所）一、无菌室的要求：无菌室是无菌检查、微生物限度检查的重要设备，面积不小于6平米，高度2.4-2.8m为宜。

建筑材料要光洁，不吸潮，无凸起，耐腐蚀，易清洗。

无菌室内部应六面光滑，无缝隙，里面连接处应呈凹凸形，不留死角。

操作间和缓冲间的门不应直对，缓冲间两个。

无菌室内采光面积要大，照明灯应镶嵌在天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于300lux，电源开关应设在室外。

无菌室、缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯，每立方米2-2.5瓦，距实验台高度不超过1米，并应定期检查辐射强度，距1米处应不低于70微瓦/平方厘米，无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置，控制温度18-26℃，相对湿度40%-60%，操作间或净化工作台的洁净空气应保持与相临环境形成正压，不低于4.9帕。

操作区洁净度100级，操作间洁净度10000级，洁净度定期检查。

无菌室及缓冲间不得存放其他杂物，如培养箱。

用消毒液清洁无菌室操作台面，开启无菌室紫外灯和层流空气过滤30分钟以上。

无菌室的无菌程度，常用的沉降菌测定方法为：取营养肉汤琼脂平板3个，置无菌室的操作区台面左、中、右位置上，开盖暴露30分钟，在30-35℃培养2天后，计算菌落数。

用于无菌检查的无菌室或微生物限度检查的无菌室，细菌总数应小于3个，浮游菌每立方米应小于5个，否则，不能用于无菌检查和微生物限度检查。

二、培养基的准备1、培养基的制备：配制培养基的蒸馏水或去离子水应符合规定。

再称取需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基的干燥培养基，加水溶化后，调节PH值，使灭菌后需气菌、厌气菌培养基的PH值为7.0-7.3，真菌培养基的PH值为6.2-6.6，分装、盖塞、灭菌，待用。

2、培养基灵敏度试验：培养基是无菌试验的基准物质，关系到无菌试验结果的科学、准确、可信度，因此，培养基灵敏度试验是无菌试验的重要组成部分。

只有使用灵敏度试验合格的培养基，才能保证无菌试验结果准确、可靠。

培养基灵敏度试验操作如下：取藤黄微球菌、生孢梭菌、白色念珠菌的新鲜培养液，分别10倍递增稀释，制成每ml 含10-100个菌，并作菌落记数。

将制备好的菌液分别加至需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基各3管。

至规定温度培养5天，每株菌接种的培养基不少于2管生长，则改培养基的灵敏度试验合格。

3、培养基用前的检查：（1）无菌检查：各种培养基在规定温度培养3天，应无菌生长。

（2）新鲜程度检查：需气菌、厌气菌培养基氧化层的颜色用前不能超过1/5，否则，不能使用。

应煮沸去氧，只限加热一次。

4、培养基的保存时限：配制好的无菌试验用培养基在2周内用完。

三、菌种复苏和保藏1、菌种复苏：先将冻干菌种的封口端用砂轮刻痕，在刻痕处过火焰数次，用无菌湿棉球炸裂后打开，然后，加入0.3-0.4ml稀释液于菌种管底部，将菌种稀释、混匀，并吸出菌液，接种于适宜的培养基。

培养时间和温度根据不同的菌种而定。

仔细检查菌种的有关特性，如无发现异常，即可传代、使用。

2、药品微生物用的菌种传代方法：取复苏好的菌种一支，接种于规定的培养基数管，培养后，置冰箱中保藏。

取出使用的菌种，经一段时间后即可废弃。

为防止微生物突变，菌种应尽量避免不必要的接种和传代。

3、菌种保藏：常用的菌种保藏方法有多种。

一般微生物实验室常用琼脂斜面和半固体低温保藏法。

大型实验室常用冷冻真空干燥法和液氮超低温保藏法。

4、菌种保藏的注意事项：破伤风梭菌、生孢梭菌选用胞肉培养基；铜绿假单孢菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，可用半固体法室温保存。

四、阳性对照菌液的制备阳性对照试验的目的是根据阳性菌在加入供试品的培养基中能否生长，以验证供试品有无拟菌活性和试验条件是否符合要求。

中国药典规定，使用的阳性菌为金黄色葡萄球菌（CMCCB26003）、生孢梭菌（CMCCB64941）、白色念珠菌（CMCCF98001）。

所有对照菌液的制备及阳性对照菌试验，必须在另一专用净化台上操作，应与其他无菌室分开。

对照菌液制备方法：通常根据供试品抗需气菌、抗厌氧菌或抗真菌的特性，选取相应的阳性对照菌培养物，制成菌液。

现以金黄色葡萄球菌为例，说明对照菌液配制的方法：取营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种于营养肉汤培养基中，在30-35℃培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每ml含10-100个菌作为对照菌液。

同时，分别取对照菌液1ml加至双碟中，倾入适量的营养琼脂培养基，制备两个平板。

培养后，以平均结果记数。

制备的对照菌液应在当日使用。

五、拟细菌拟真菌实验中国药典2000年版增订了拟细菌拟真菌实验，在实验前必须对供试品的拟菌性有一些了解。

取需气菌、厌气菌培养基4管，真菌培养基2管，其中2管需气菌、厌气菌培养基分别加10-100个金黄色葡萄球菌，另2管分别加生孢梭菌。

真菌培养基2管分别加10-100个白色念珠菌，其中1管加定量供试品。

所有培养基管置规定温度培养3-5天，观察结果，如各培养基管24小时内微生物生长良好，则供试品无拟菌作用；如加供试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢或不生长，均判供试品有拟菌作用。

供试品如无拟菌作用，可采用直接接种法。

对有拟菌作用的供试品，可采用稀释法、中和法或薄膜过滤法。

六、操作人员的准备操作人员准备进入无菌室：操作人员关闭紫外灯，用洗手液洗手，进入缓冲间换工作鞋、消毒手、戴帽、穿无菌衣、口罩、手套，不得戴装饰物。

在缓冲间着无菌装时，袖口不能翻转折叠，严防暴露手腕。

七、无菌检查无菌检查法包括直接接种法、薄膜过滤法，前者适用于非抗菌作用的供试品，后者适用于有抗菌作用或大容量的供试品。

1、直接接种法：取供试品11支，用消毒液浸泡或擦拭，划痕，用75%酒精消毒棉球或碘伏棉球擦拭，过火焰，搬断，用无菌玻璃注射器或一次性注射器取规定量供试品，接种至需气菌、厌气菌培养基6管，接种真菌培养基5管，同时取供试品稀释液接种需气菌、厌气菌培养基和真菌培养基各1管做阴性对照，其中1管接种10-100个对照菌作阳性对照。

需气菌、厌气菌培养基管置30-35℃，真菌培养基管置20-25℃，培养7天，逐日观察记录结果。

接种供试品后或培养过程中，如培养基中出现浑浊现象，培养7天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量，转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上继续培养，细菌培养2天，真菌培养3天，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用接种环取培养液涂片、染色，用显微镜观察是否有菌。

2、薄膜过滤法：将灭菌的排液槽安装好，取三元一次性集菌培养器，将滤器导管放在集菌仪的移动泵管槽内，进液导管的双星针头插在0.9%的无菌氯化钠冲洗液的胶塞上，启动集菌仪，将冲洗液瓶倒置在支架上，冲洗液自滤器下孔流出即可。

关集菌器。

取供试品6瓶，用消毒液浸泡或擦拭，去铝盖或塑料盖，瓶塞过火焰，用注射器取氯化钠注射液适量注入瓶中，使供试品充分溶解。

用注射器将供试液分别转移至100ml稀释液中，摇匀，尽快将进液导管上的双星针头插入该瓶塞上，同时启动集菌器，过滤，直到滤膜上无药液。

将6瓶供试品稀释液全部过滤。

用1000ml的氯化钠溶液冲洗薄膜，每冲洗100ml适当摇动滤器，抽滤干净，冲洗3次。

用夹子加紧滤器上一个进液导管的前端，将每个滤器上的排气孔胶帽取下，堵在滤器底部的排液孔上，各加入100ml需气菌、厌气菌培养基于2个滤器内，取下第一个夹子，再用两个夹子加紧另外2个滤器进液导管的前端，加入100ml真菌培养基于第三个滤器内，前两元滤器中的一个要加入金黄色葡萄球菌10-100个，作阳性对照。

另取两元一次性集菌培养器安装于集菌仪上，用200ml氯化钠溶液冲洗薄膜，用夹子加紧一个滤器的进液导管的前端，然后加入100ml需气菌、厌气菌培养基。

取下夹子，再用夹子加紧另一个滤器进液导管的前端，加入100ml真菌培养基，作阴性对照。

需气菌、厌气菌培养基管置30-35℃，真菌培养基管置20-25℃，培养7天，逐日观察记录结果。

3、无菌检查结果判断：当阳性对照管显浑浊并确有菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得结果判定。

如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或浑浊，但经证明并非有菌生长，均为供试品合格；如需气菌、厌气菌及霉菌培养基管中任何一管显浑浊，并确有菌生长，应取样并分别依法复试。

除阳性对照管外其他各管均不得有菌生长，否则，应判定供试品为不合格。

八、微生物限度检查1、供试液的制备：（1）固体供试品固体供试品包括片剂、丸剂、胶囊剂。

称取供试品10g放入灭菌好的匀浆杯中，加稀释剂100ml，启动匀浆仪,以每分钟3000转，旋转3分钟，使供试液均匀，制成1：10供试液。

（2）液体供试品取供试品10ml放入已灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，使均匀，制成1：10供试液。

（3）非水溶性供试液制备称供试品5g，加入装有已灭菌融化的温度约45℃的司盘-80 5g，单硬脂酸甘油3g和聚山梨酸10g混合物锥形瓶中,摇匀，加0.9%灭菌氯化钠溶液80ml使供试品充分乳化，制成1：20供试液。

2、细菌霉菌（酵母菌）计数：以固体供试液为例，供试液以10倍递增稀释，将匀浆杯中内容物摇匀，取2-3支灭菌中试管，分别加入9ml灭菌稀释剂。

另取一支1ml灭菌吸管，吸取供试液1ml，加入第一支试管中，混匀，制成1：100的供试液，以此类推，作10倍递增稀释。

根据供试品污染的程度可稀释至10-3或10-4，一般取连续三级稀释液检验。

取吸管分别吸取1ml 10-1供试液加入4平皿中。

再取另一支吸管分别取第二级稀释液1ml加入4个平皿中，第三级稀释液同样操作。

将45℃左右的营养琼脂培养基按每一级稀释液倒入2个平皿，每个平皿15-20ml，立即摇匀。

再取玫瑰红钠琼脂培养基按每一级稀释液倒入2个平皿，同样操作。

细菌数和灭菌数的阴性对照试验：分别吸取稀释剂各1ml加入到4个平皿中，再分别加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基各制成2个平板。

检查细菌的平板倒置于30-35℃培养箱中，培养2天。

检查霉菌的平板倒置于25-28℃培养箱中，培养3天。

逐日观察并记录结果。

阴性对照的平板培养后均不得长菌。

3、大肠杆菌检查：取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，两份分别加入规定量的供试液，其中一份加对照菌50-100个作阳性对照。

第三份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照，培养18-24小时。

阴性对照应无菌生长。

取上述三份培养物各0.2ml，分别接种至5mlMUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时时取未接种的MUG培养基管作本底对照。

将各管置366nm紫外灯下5cm处观察有无蓝白荧光，然后，加靛基质试液4-5滴于上述MUG培养基管内，适当震摇后，观察液面颜色。