（一）酶和底物
一）酶的适用要求： 1、催化效率高 2、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定 3、酶催化底物产物应易于判定或测定 4、酶活性不受样品中其它成分的影响 5、酶、底物等性质稳定、价廉易得,对人体无危害
二）常用的酶： 辣根过氧化酶（ horseradish peroxidase, HRP） 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ,AP） 其他：葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等
酶
戊二醛
免疫球蛋白
----> Fe-E-N=C-(CH2)3-C=N-Ig + 2H2O
CH2OH H
H
酶结合物
水
2、过碘酸盐氧化法：
HIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再
与Ig上的氨基相结合。本法只用于HRP的交联
NaIO4
NH2
NH2
(1) Fe—E CH2OH + O ---->Fe— E CHO + H2O
单克隆抗体
（六）免疫吸附剂（immunosorbent）
一）定义：固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂；
疏水基团间的作用 二）包被（coating） 1、定义：将抗原或抗体固相化的过程 2、包被方法（直接吸附法）：
抗原（抗体）/碳酸缓冲液（pH9.6 ）包被浓度100ng/ml-20ug/ml
（1）具有较强的吸附蛋白质性能 （2）抗原或抗体吸附其上后保留原来的免疫活性 （3）仅作为吸附剂和容器，不参与化学反应
2、固相载体的种类与选择
（1）塑料制品
聚苯乙烯、聚氯乙烯 材料经济，操作简便，易于自动化
最常用(微量反应板* )
（2）微颗粒
结合容量大，反应迅速 逐渐普遍用于自动化分析
（3）膜载体
405nm波长处有最高吸收峰
（2）发荧光底物：磷酸4-甲基伞酮 可用于ELISA作荧光测定
* AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率
低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。
３、β-半乳糖苷酶：
常用底物：4-甲伞酮基-β-D半乳糖苷 产物: 4-甲基伞形酮（荧光物质）
（三）酶结合物(Enzyme Conjugate)
常用的供氢体(底物）： 邻苯二胺（O-phenylenediamine, OPD）:反应显橙黄
色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB）:
反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差 ABTS (2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)
一）定义： 酶标记的抗体（或抗原） EIA中最关键的试剂
二）结合物要求： 1、保有酶的催化活性 2、保持抗体（或抗原）的免疫活性 3、有良好的稳定性
三）制备方法:
1、戊二醛交联法: 常用于HRP或AP标记抗体或抗原
原理：
NH2
Fe—E CH2OH + OHC-(CH2)3-CHO + H2N-Ig
底物
定性、定量分析
一、 技术要点： 试剂的制备 反应条件的选择 操作的标准化
必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”
（immunosorbent） （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”
（conjugate） （3）酶反应的底物 (substrate)
其他试剂： 1、对照品和参考品 阳性对照品（positive control，PC） 阴性对照品（negtive control，NC） 参考标准品：定量测定时制作标准曲线用 2、洗涤液：常用PBS 3、终止液：强酸或强碱
1、辣根过氧化酶 （ horseradish peroxidase, HRP）
（1）分子结构：
主酶（糖蛋白）: 在275nm波长处有最高吸收峰 辅基（亚铁血红素）：酶活性基团
在403nm波长处有最高吸收峰
（2）HRP的底物 ： HRP催化的反应式： DH2+ H2O2 HRP D+ H2O
DH2为供氢体，H2O2为受氢体。
①HRP催化OPD的反应：
492nm波长处有最高吸收峰
②HRP催化TMB:无色
蓝色 终止液 黄色
在450nm波长处有最高吸收峰
２、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ,AP）
底物：
（1） 对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)
AP催化p-NPP的反应：
NH2
NH2
(2) Fe—E CHO + H2N-Ig ---> Fe—E C=N-Ig + H2O
H
结合物中混有的游离酶: 一般不影响ELISA中最后的酶活性测定 游离的抗体:
与酶标抗体竞争相应的固相抗原 因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体
后用于检测，效果更好
（四）固相载体
1、材料要求:
硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜等微孔滤膜 广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H
(五）抗原和抗体 一）抗原 1、要求：纯度高，抗原性完整 2、来源：天然抗原 重组抗原 合成多肽抗原 二）抗体
1、要求：特异性好、 效价高、亲和力强 2、来源：多克隆抗体
酶免疫技术
Enzyme Immunoassay
侯珏
临床微免教研室
目的要求 1．掌握酶联免疫吸附试验的原理、方法类型
及各类型原理 2. 掌握酶免疫技术的必要试剂 3．熟悉膜载体的酶免疫测定 4．熟悉酶免疫技术的分类 5．熟悉酶免疫技术的特点 6．了解酶免疫测定的应用
标记免疫技术 一、基本概念 免疫技术 : Ag+Ab
分类： 根据标记物不同
荧光免疫技术 放射免疫分析 传统三大标记技术 酶免疫技术 发光免疫技术 金免疫技术 生物素-亲和素免疫技术
酶免疫技术(Enzyme Immunoassay)
概述
酶免疫技术定义:
Ag-E + Ab Ab-E + Ag
E-Ag Ab Ag Ab-E
抗原抗体的免疫反应 +
酶的高效催化作用
AgAb
标记免疫技术= 免疫技术+标记技术
测定复合物中的标记物
Ag*+Ab

Ag*Ab
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
灵敏性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
二、分类： 按检测对象分类
免疫组化技术: （immunohistochemical technique）
组织切片标本
免疫测定（immunoassay）: 液体标本