生化分离考点Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】1.生化分离过程的特点：（1）生物物质的生活活性大多是在生物体内的温和条件下维持并发挥作用的；（2）用作医药、食品和化妆品的生物产物与人类生命息息相关；（3）原料液中常存在与目标分子在结构、构成成分等理化性质上极其相似的分子及异构体，形成用常法难于分离的混合物；（4）原料液中目标产物的浓度一般很低，有时甚至是微量的。

2.分离效率的评价（三个指标）：浓缩程度、分离纯化程度、回收率3.Stokes为液体密度式中，d p kg/m3），ρL为重力沉降速度（kg/m3），μ（kg/m3），g 为重力加速度（kg/m3），vg为液体黏度。

L4.区带分离法：是生化研究中的重要分离手段，根据立新操作条件不同，分为差速区带离心和平衡区带离心，两种区带离心法均事先在离心管中用某种低分子溶质调配好密度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液后进行离心操作。

5.离心分离设备：常用的有管式和碟片式两大类。

6.革兰氏阴性和阳性的区别：革兰阳性菌的细胞主要由肽聚糖层组成，而革兰阴性菌的细胞壁在肽聚糖层的外侧还有分别由脂蛋白和脂多糖及磷脂构成的两层外壁层。

革兰阳性菌的细胞壁比较厚，约15-50nm，肽聚糖含量占40%-90%；革兰阴性菌的肽聚糖层约，外壁层约8-10nm。

因此，革兰阳性菌的细胞壁比革兰阴性菌坚固，较难破碎。

7.习题：管式离心机的转筒内径为12cm，筒长70cm，转数为15000r/min。

设离心机的校正系数为一，利用其浓缩酵母细胞悬浮液，处理能力为min。

（1）计算酵母细胞的重力沉降速度；（2）破碎该酵母细胞后，细胞碎片直径减小到原细胞的1/2，液体黏度上升3倍，在相同条件下离心浓缩该细胞破碎液，试计算此时离心机的处理能力。

(1)2222g Lr w Q v gπ=,72222249.8 4.1810/1500022 3.140.70.12()60g Qg v m s Lr w π-⨯===⨯⨯⨯⨯⨯ (2)21212111,,216p p L L g g d d v v μμ=== 8. 盐析原理： 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析(Salting-out)。

当离子强度较高时，溶解度的对数与离子强度之间呈线性关系，用Cohn 经验方程描述：S-蛋白质的溶解度，g/Lβ-常数；Ks －盐析常数；I －离子强度，mol/L蛋白质的水溶液逐渐加入电解质时，开始阶段蛋白质的活度系数降低，并且蛋白质吸附盐离子后，带电表层使蛋白质分子间相互排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用却加强，因而蛋白质的溶解度增大，这种现象称为盐溶(salting-in)。

随着离于强度的增大，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱，同时，由于盐离子的水化作用使蛋白质表面疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出疏水区域，从而增大了蛋白质表面疏水区之间的疏水相互作用，容易发生凝聚，进而沉淀。

这种现象称为盐析(salting-out)9. 影响盐析的因素:无机盐的种类、浓度、温度和pH 值 。

I K S S -=βlog10. 阳离子，阴离子盐析作用的顺序：阴离子的盐析作用顺序为P0-34>S0-24>CHCOO ->CI ->NO3—>C1O 4->I->SCN - 阳离子的盐析作用的顺序为NH +4>K +>Na +>Mg 2+11.习题2：有100L 蛋白质溶液，其中含牛血清白蛋白（BSA ）和另一种杂蛋白（X ）,质量浓度分别为10g/L 和5g/L,拟用硫酸铵沉淀法处理该溶液，回收沉淀中的BSA 。

20℃下BSA 和X 的Cohn 方程参数列于下表（假设其他蛋白的存在不影响方程参数），其中离子强度用硫酸铵浓度表示，蛋白质质量浓度单位为g/L ，硫酸铵浓度单位为mol/L.蛋白质 β KsBSAX（1）如果溶液体积变化与硫酸铵加入量成正比，若回收90%的BSA ，需要加入多少硫酸铵（2）沉淀中BSA 的纯度是多少解：按体积不变（1）1,s S lg K I β=- ()2212.823211232i i i I c c c ==⨯⨯+⨯⨯=，2.82310%101/,0.9413i S g L c =⨯===， 加入()442NH SO 0.94110013212.42kg ⨯⨯=，lg 20.0 6.8520.0 6.85 2.8230.38, 4.59/X I X g L =-=-⨯=-=，()90%10/10095.6%5 4.59/10090%10/100g L L g L L g L L⨯⨯-⨯+⨯⨯ 11.膜在分离过程中具有如下功能：①物质的识别与透过；②界面；③反应场。

反渗透 (Reverse osmosis ，RO)超滤 (Ultrafiltration ，UF)微滤 (Microfiltration ，UF)透析 (Dialysis ，DS)电渗析 (Elecrodialysis ，ED)渗透气化 (Pervaporation ，PV)超滤和微滤及RO 都是利用膜的筛分性质，以压差为传质推动力。

反渗透RO 膜无明显的孔道结构 ，透过机理多采用溶解-扩散模型表述；反渗透的操作压力常达到几十个大气压;随着压力升高，溶剂的体积通量线性增大，而溶质的质量通量与压力无关; 提高反渗透操作压力有利于实现溶质的高度浓缩 （适用于1nm 以下小分子的浓缩 ）。

超滤(UF)和微滤(MF)都是利用膜的筛分性质，以压差为传质推动力；UF 膜和MF 膜具有明显的孔道结构 ，主要用于截留高分子溶质或固体微粒 ；操作压力低，膜的透过通量与压差成正比，与滤液粘度成反比 ；UF 法适用于分离或浓缩直径1—50nm 的生物大分子(蛋白质、病毒等)；MF法适用于细胞、细菌和微粒子的分离，目标物质的大小范围为μm～10μm。

透析过程以浓差为传质推动力，膜的透过通量很小；常用于肾衰竭患者的血液透析，在生物分离方面，主要用于生物大分子溶液的脱盐。

电渗析是利用分子的荷电性质和分子大小的差别进行分离的膜分离法；所用的膜材料为离子交换膜；在工业上多用于海水和苦水的淡化以及废水处理；作为生物分离技术，电渗析可用于氨基酸和有机酸等生物小分子的分离纯化。

渗透气化又称膜蒸馏，根据溶质间透过膜的速度不同，使混合物得到分离；渗透气化膜主要为多孔聚乙烯膜、聚丙烯膜和含氟多孔膜；适用于共沸物和挥发度相差较小的双组分溶液的分离。

12. 对膜材料的要求：起过滤作用的有效膜厚度小，开孔率高，过滤阻力小；膜材料为惰性，不吸附溶质(蛋白质、细胞等)，不易污染，膜孔不易堵塞；适用的pH和温度范围广，耐高温灭菌，耐酸碱清洗剂，稳定性高，使用寿命长；容易通过清洗恢复透过性能；能满足实现分离目的的各种要求。

12.对称和不对称膜的区别：对称膜(symmetric membrane) ：传质阻力大，透过通量低，并且容易污染，清洗困难；不对称膜(asymmetric membrane) ：透过通量大、膜孔不易堵塞、容易清洗。

13.膜组件：管式膜组件、平板膜组件、螺旋卷式膜组件、中空纤维式膜组件；14.管式面膜组件:内径较大，结构简单，适合于处理悬浮物含量较高的料液;清洗比较容易;单位体积的过滤表面积(即比表面积) 小。

平板膜组件：平板膜组件比管式膜组件比表面积大得多；实验室中使用将一张平板膜固定在容器底部的搅拌槽式过滤器。

螺旋卷式膜组件：比表面积大，结构简单，价格较便宜；处理悬浮物浓度较高的料液时容易发生堵塞现象。

中空纤维式膜组件：耐压能力较高；可以采用外压式操作和内压式操作。

14.浓度极化模型：在膜分离操作中，所有溶质均被透过液传送到膜表面上，不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作用，在膜表面附近升高。

这种在膜表面附近浓度高于主体浓度的现象称为浓度极化或浓差极化（concentration polarization）。

15.截留相对分子量：通过测定相对分子质量不同的球形蛋白质或水溶性聚合物的截留率，可获得膜的截留率与溶质相对分子质量之间的关系曲线，即截留曲线，一般在截留曲线上截留率为（90%）的溶质的相对分子质量定义为膜的截留相对分子质量(molecular mass cut-off, MMCO)。

16..膜污染的主要原因：• 凝胶极化引起的凝胶层；• 溶质在膜表面的吸附层；• 膜孔堵塞；• 膜孔内的溶质吸附。

清洗：选用水、盐溶液、稀酸、稀碱、表面活性剂、络合剂、氧化剂和酶溶液等为清洗剂 ；• 使用清洗剂时要根据膜的性质和污染物的性质而定，即使用的清洗剂要具有良好的去污能力，同时又不能损害膜的过滤性能；• 清洗的结果能够提高膜的透过性能，而且可延长膜的使用寿命。

16.膜分离法的应用：细胞培养基的除菌； (1)发酵或培养液中细胞的收集或除去； (2)细胞破碎后碎片的除去 ；(3) 发酵或培养液中细胞的收集或除去； (4)目标产物部分纯化后的浓缩或洗滤除去小分子溶质； (5)最终产品的浓缩和洗滤除盐； (6)制备用于调制生物产品和清洗产品容器的无热原水。

17. 萃取定义：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法称为萃取。

原理萃取是一种初步分离纯化技术，根据参与溶质分配的两相不同而分为多种，如液固萃取、液液有机溶剂萃取、双水相萃取和超临界流体萃取等，每种方法均各具特点，适用于不同种类生物产物的分离纯化。

18.萃取传质单元数：0011,**x y x y x y dx dy NTU NTU x x y y==--⎰⎰分别为料液相和萃取相的总传质单元数；传质单元高度：,y x x y x y U U HTU HTU K a K a==分别为料液相和萃取相的总传质单元高度19.双水相萃取法（Aqueous two-phase extraction ），又称双水相分配法(Aqueous two —phase partitioning)。

原理：某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统（aqueous two-phase system ，ATPS ）。

系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。

当系线长度趋向于零时，即在图的双节线上K 点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，因此K 点称为临界点(critical point)。

20.影响分配系数的各种因素：（1）成相聚合物和浓度；（2）盐的种类和浓度；（3）pH 值；（4）温度21.相平衡与相分离双水相萃取过程包括以下几个步骤1. 双水相的形成2. 溶质在双水相中的分配3.双水相的分离22.液膜萃取；可同时实现萃取和反萃取，这是液膜萃取法的主要优点之一，对于简化分离过程、提高分离速度、降低设备投资和操作成本是非常有利的。