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（二）。PCR反应的主要成分和作用
• 1。DNA聚合酶：PCR反应使用的是耐热DNA聚合酶。
•
比如：Taq DNA聚合酶。
• 可分为两大类： （1）具有校正功能的（有3‘5’核酸酶活性）
比如：Vent,pfu,pwo等
2。引物
（2）不具有校正功能的 （无3‘5’核酸酶活性） 比如：一般的Taq DNA聚合酶
（1）引物长度以15~30个bp为宜。引物过短会使特异性降低， 过长时则成本增加，且也会降低特异性。
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（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶堆积现象， 引物G+C含量宜在45~55%左右。
（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3‘末端不应 有互补链存在。
（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时 进行辅助检索分析。
PCR产物为模板，再在内侧设计一对引物扩增出我们所要的目的 片断。
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二 PCR的应用
（一）未知DNA片断的克隆
1，基因组DNA步移法
12345
接头
已知DNA序列
接头
PCR
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• 2，Inverse PCR
限制酶切点（X）
已知序列
限制酶切点（X）
限制酶X酶切
连接
引物1
引物2
PCR
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（三）．怎样提高PCR的特异性
• 1．热启动（hot-start)
•
比如（1）将Taq酶与其它反应体系通过石蜡分隔开
•
（2）利用Taq酶的单克隆度下进行几轮PCR循环，然后再在 退火温度 下进行大量扩增。
• 3. Nested PCR • 先在要扩增片断的外侧设计一对引物，进行PCR，然后以此
（5）引物3‘末端碱基：原则上要求引物3’末端与模板DNA一定要配对。 另外引物3‘末端的末位碱基在很大程度上影响着Taq DNA聚合酶 的延伸效率。研究表明，引物3‘末端碱基在错误配对时，不同碱基 的引发效率存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情 况下，也能引发链的合成。而末位碱基为T时，错配时引发效率 大大降低。G,C居于中间，所以3‘末端的末位碱基最好选T,G,C而 不选A.
组成
50mM KCl
10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2
Mg++是Taq酶活性所必需的金属离子。 Mg++浓度的高低能影响反应 的特异性和扩增片断的产率。1.5~2.0mM Mg++是比较合适的。 Mg++ 过量能增加非特异性扩增并影响产率。
4。底物dNTP浓度
在PCR反应中，dNTP浓度应在20~200uM, dNTP浓度过高可加快反应 速度。同时，还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度 的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高实验的精确性。此外，由于 dNTP可能与Mg++ 结合，因此应注意Mg++浓度和dNTP浓度之间的关系。
(6) 引物5‘末端碱基：PCR反应物5’末端碱基并没有严格限制， 只要与
模板DNA结合的引物程度足够，其5‘末端碱基可以不 与模板DNA匹
配，而呈游离状态。这样引物设计时可以在5‘末端加上限制性内切酶
位点或其他短的序列。可以加ATG起始密码，可以加错配碱基造
成突变。
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3。PCR反应缓冲液：
分子生物学研究方法
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PCR技术在医学中的应用
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• 一.多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaciton,PCR)
• （一）原理
热变性（94度）
退火（55度）
引物
延伸（72度）
DNA聚合酶 dNTP
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变性
引物
退火
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经25~30次循环， 目的DNA增加166-7