1 1 范围本标准规定了绵羊的胚胎生产和移植的供体羊的选择和饲养管理、供体羊的超数排卵及人工授精、手术冲卵技术及胚胎质量鉴定、冻胚的解冻、受体羊的选择及饲养管理、胚胎手术移植技术和妊娠受体羊的饲养管理技术。

本标准适用于秦皇岛地区绵羊的胚胎生产和移植。

2 2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。

凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

DB 1303/T 098-2000 羊的人工授精技术操作规程3 3 供体羊的选择和饲养管理3.1 3.1 供体羊的选择a）a）体羊品种优良、生产性能好；b）b）传性稳定、谱系清楚；c）c）体质健壮。

繁殖机能正常，无遗传和传染性疾病。

年龄在2岁至7岁为宜；d）d）具有畜牧部门颁发的种畜禽鉴定合格证书。

3.2 3.2 供体羊的饲养管理3.2.1 3.2.1 保持饲养环境稳定，饲养环境卫生、干燥、棚舍温度适宜。

避免应激反应。

3.2.2 3.2.2 制定合理的供体羊日粮配方，保证正常的营养平衡。

3.2.3 3.2.3 满足供体羊清洁饮水的需要。

4 4 供体羊的超数排卵及人工授精4.1 4.1 超数排卵4.1.1 4.1.1 超数排卵的季节和发情周期：绵羊最适超数排卵季节为9月下旬至11月上旬。

绵羊的发情周期在15d—17.5d。

供体母羊在超数排卵前需观察1—2个完整的发情周期。

4.1.2 4.1.2 用于超数排卵的激素选择FSH—P（垂体促滤泡素） LH—P（垂体促黄体生成素） ICI80996（氯前列烯醇）4.1.3 4.1.3 激素剂量（注射总量/只）FSH—P剂量（肌注）：120IU—160IULH—P剂量：根据FSH的注射剂量，肌注100—120IU。

ICI80996：肌注0.08mg/次，注射两次/d。

4.1.4 4.1.4 超数排卵方法FSH—P 3天注射法以母羊发情之日作为发情周期的0d，在母羊发情周期的第13d或13.5d（周期大于17.5d的羊在第13.5d）开始，每天早：（6：00—7：00）和晚（18：00—19：00）各注射1次FSH，连续3天，递减注射。

FSH、LH用生理盐水稀释。

在第5、6次注射FSH—P时，同时肌肉注射ICI80996。

确定供体羊发情后立即注射LH。

如果FSH—P未注射完供体羊已发情，停止注射FSH—P，立即注射LH。

4.1.5 4.1.5 供体羊发情鉴定在第6次注射FSH—P时即对超排供体羊观察发情。

观察时间：早（6：00-7：00），晚（18：00-19：00）。

观察方法：试情公羊扎好试情布，放入母羊群中试情，每30-40只供体羊需1只试情公羊，以母羊站立接受试情公羊爬跨作为发情的标准。

4.2 4.2 人工授精4.2.1 4.2.1 种公羊的选择标准品种优良，谱系清楚，遗传性稳定、生产性能良好，健康无病。

精液品质符合DB 1303/T 098-2000的规定。

4.2.2 4.2.2 人工授精操作要求a)采精前对种公羊外生殖器清洗消毒。

采精、精液稀释、输精用的器皿严格灭菌、消毒。

b)稀释后的精液温度要保持在25℃-30℃的环境中。

c)输精前，母羊外阴部必须经过清洗消毒。

d)输入的鲜精授精精液活力在0.7以上，每次输精有效精子数不少于30×106。

输精次数不少于2次。

e)选择合适的输精枪和准确的输精部位。

4.2.3 4.2.3 人工授精的最适合时间确认发情时立即进行第一次输精，之后每间隔12h输精1次，一般输2-3次。

5 5 手术冲卵技术及胚胎质量鉴定5.1 5.1 手术冲卵5.1.1 5.1.1 所需主要器材手术台 1 ；剃须刀 1 ；创布 2-3块；止血纱布若干；剪毛剪 1；手术刀柄 1；手术剪 1；止血钳 3-4；巾帕钳 4；持针器 1；肠钳（带乳胶管） 1；手术刀片若干；缝合线；缝合针；镊子 2；φ120mm表面皿若干；φ180mm表面皿若干；6＃-8＃头皮针（尖端磨钝）若干；18＃-20＃头皮针（尖端磨钝）若干；φ10mm透明硅胶管若干；10ml注射器 2-3；20ml注射器 2-3；φ8mm玻璃管若干；φ35mm培养器若干。

5.1.2 5.1.2 冲卵所需药品酒精、碘酊、新洁尔灭、0.9%生理盐水、青霉素、链霉素、液体石蜡、肝素5.1.3 5.1.3 冲卵液（保存液）的准备购置杜氏磷酸缓冲液（PBS），PBS液中加0.4%的牛血清白蛋白即为保存液，可用于胚胎的体外操作和保存，也可直接作为冲卵液使用于手术法冲胚和移植。

5.1.4 5.1.4 手术冲卵技术步骤按附录A做好采胚记录5.1.4.1 5.1.4.1 制作喇叭口导卵管a)将φ8mm的玻璃管断成10cm-12cm长度，洗净、烘干。

b)将玻璃管中段放在酒精灯上灼烧，拉长为10cm，直径约3mm-4mm即可。

c)冷却后将中间拉细部分截断，将截下部分的一端（φ3mm）在酒精灯上烧结圆滑，但不能变形。

d)在离圆滑端3cm处，用酒精灯缓慢加热，使之弯曲成1200即可。

5.1.4.2 5.1.4.2 手术冲卵法5.1.4.2.1 5.1.4.2.1 手术前24h停止饲喂草料，只满足饮水。

5.1.4.2.2 5.1.4.2.2 保定、麻醉：将母羊仰卧保定，局部麻醉。

5.1.4.2.3 5.1.4.2.3 手术部位：在离乳房前端约2cm处，腹中线的两侧均可。

5.1.4.2.4 5.1.4.2.4 术部剪毛：剪毛范围约20cm×20cm。

用肥皂水清洗手术部，同时用剃须刀剃净毛茬，再用清水洗净。

5.1.4.2.5 5.1.4.2.5 术部消毒：首先用0.1%的新洁尔灭清洗手术部位；然后用5%碘酊棉球对手术部位由中心向外扩散消毒、凉干；最后用75%酒精棉球对手术部位由里到外消毒、脱碘、凉干。

5.1.4.2.6 5.1.4.2.6 避开血管，用手术刀于术部纵向切开6cm-8cm长的刀口，将皮下结缔组织分离，暴露肌膜。

5.1.4.2.7 5.1.4.2.7 用手术刀将肌膜轻轻切开，暴露肌肉层，再用刀柄后端将肌肉层和腹膜钝性剥离开。

5.1.4.2.8 5.1.4.2.8 在骨盆腔，膀胱周围触摸子宫角并将卵巢、子宫引出切口外，分别记录两侧卵巢黄体和滤泡数。

5.1.4.2.9 5.1.4.2.9 输卵管冲胚在超排母羊发情后66h-72h从输卵管采集2-8细胞胚胎，进行鲜胚移植。

方法：用6＃-8＃头皮针从子宫输卵管接合部的子宫端导入到输卵管峡部，将喇叭口导卵管从输卵管喇叭口插入3cm-4cm，导卵管远端与￠120mm表面皿相接，助手事先用10ml注射器抽取5ml-8ml冲卵液，与头皮针相接，把冲卵液缓缓推入输卵管，胚胎即随同冲卵液自输卵管回收到表面皿中，另一侧输卵管冲胚操作方法同上。

5.1.4.2.10 5.1.4.2.10 冲胚完毕后，用一定浓度的肝素溶液喷洗内脏，洗掉凝血块。

用25℃-30℃的生理盐水将内脏冲洗干净；将5ml-10ml（25℃-30℃）灭菌液体石蜡注入腹腔，以防粘连。

5.1.4.2.11 5.1.4.2.11 供体母羊创口采用三层缝合法。

即腹膜、肌肉连续缝合；皮肤结节缝合，针脚间距1cm。

在肌肉与皮肤间撒适量青、链霉素粉，以防创口感染。

5.1.4.2.12 5.1.4.2.12 手术后母羊需观察24小时后才能跟群放牧。

手术器械在使用前用0.5%新洁尔灭液浸泡0.5h；术者分工要明确，严格按外科手术规则进行自身消毒，不得接触其他无关的物品；整个采胚过程的操作要迅速、准确、仔细，避免生殖器官暴露过久，切记频繁、重复触摸和拉扯生殖器官，以防脏器粘连。

5.2 5.2 胚胎质量鉴定5.2.1 5.2.1 检卵把盛有冲卵回收液的表面皿放在立体显微镜下，仔细观察，不可遗漏，将检出的胚胎放入盛有保存液的￠35mm培养皿中。

超排母羊发情后66h-72h用输卵管冲胚法采集2细胞、4细胞、8细胞及少数16细胞胚胎。

上述发育期按国际胚胎移植协会规定的数码均表示为2。

5.2.2 5.2.2 胚胎的质量鉴定——形态学方法处于发育期2细胞的胚胎，卵裂球轮廓清楚，球体饱满，透明度适中，数目吻合即可定为1级；1/3卵裂球死亡可定为2级；1/2卵裂球死亡可定为3级；其余定为4级。

1、2、3级胚胎均可用于鲜胚移植。

6 6 冻胚的解冻进行冻胚移植时，购置的冷冻胚胎在移植前需进行解冻操作。

6.1 6.1 胚胎解冻所需的仪器、器材立体显微镜、温度计、解冻用水杯、0.25ml塑料细管、吸卵管、细管推杆、装管器、￠100mm塑料培养皿、0.22μm针头式细菌滤器。

6.2 6.2 胚胎解冻所需溶液保存液：含0.4%牛血清白蛋白的PBS液。

解冻液：1M蔗糖/保存液。

6.3 6.3 胚胎解冻方法胚胎解冻方法应根据胚胎冷冻方法而定，一般采取的方法是1.5M乙二醇/保存液（含1M蔗糖）冷冻胚胎的解冻：胚胎→32℃水浴10秒→擦干细管→用70%酒精棉球擦拭细管，晾干→剪去细管塞→移植（胚胎解冻后2-3分钟内移入受体）。

6.4 6.4 胚胎发育期与受体移植时间的对应关系胚胎发育期受体移植时间（发情之日为0h）紧缩桑椹胚（M） 5.5±0.5d早期囊胚（EB） 5.5±0.5d囊胚（B） 6.0±0.5d扩张囊胚（EXB） 6.5±0.5d7 7 受体羊的选择及饲养管理要求7.1 7.1 受体羊的选择a)情周期，无繁殖机能疾病，经检疫无传染疾病，健康、膘情在七成以上。

b)年龄在1.5岁-6岁之间。

7.2 7.2 受体羊的饲养要求受体羊单独组群加强饲养，保持环境相对稳定，避免应激反应。

8 8 胚胎手术移植技术8.1 8.1 受体羊的同期化发情处理8.1.1 8.1.1 同期化发情处理方法药品：ICI80996（氯前列烯醇），0.2mg/2ml/支剂量：0.07mg/只/次方法：二次注射法（肌注）第一次注射在任意一天；第二次注射在第一次注射后7d，第二次注射后24-96h观察发情。

受体羊发情之日为0d，按胚龄要求进行移植。

8.1.2 8.1.2 2细胞——扩张囊胚的胚胎，鲜胚移植时供、受体羊发情的同期化要求8.1.2.1 8.1.2.1 供、受体羊均采用试情公羊确认发情。

观察时间：每天早、晚各一次。

8.1.2.2 8.1.2.2 把供体羊发情之日定为0d，与供体羊同时发情的受体羊定为0h受体。

比供体羊提前12h发情的定为＋12h受体，提前24h的定为＋24h受体。

比供体羊推迟12h发情的受体定为－12h 受体，推迟24h的定为－24h受体。