右，因为当质粒大于15kb时，转化效率明显下降。
理想的质粒载体
(1)分子量小、多拷贝、松弛控制型; (2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点; (3)能插入较大的外源DNA片段; (4)具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和 筛选。 (5)对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一 般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、 PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
• 右侧区：位于Ｎ基因的右侧，包括全部主要的调控 成分，噬菌体复制基因（Ｏ和Ｐ）以及溶菌基因 （Ｓ和Ｒ）
注意
• λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶 菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基 因编码的蛋白质，同λ噬菌体的两个操纵基因 （OL, OR)之间的相互作用来决定的。
• 如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，那 么噬菌体便可以进入溶菌周期，否则进行溶源 周期。
酶形成融合蛋白质的克隆载体。
质粒载体
质粒特点
• ①染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed
circuar DNA,cccDNA）可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯
化，＞15kb的大质粒则不易提取。
• ②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous
构建λ噬菌体载体的基本原理
• 野生型的λ噬菌体DNA，对大多数基因克 隆中常用的核酸内切酶都有过多的限制位 点，通过消除一些多余的限制位点和切除 非必要的区段，才可能将它改造成适用的 克隆载体。
λ噬菌体载体可分为：
插入型载体 替换型载体
插入型载体
• 免疫功能失活的插入型载体：载体基因组 上存在一段免疫区，其中带有一两种核酸 内切限制酶的单切割位点。当外源DNA插 入到这种位点上时，就会使载体所具有的 合成性阻遏物的功能遭受到破坏，而不能 进入溶源周期。因此带有外源DNA插入的 λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没 有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成浑 浊的噬菌斑。
Β-半乳糖苷酶失活的插入型载体
• 载体基因组中含有一个大肠杆菌的 lac5区段，编码着Β-半乳糖苷酶基因 lacZ。由这种载体感染到的大肠杆菌 lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal 的培养基上就会形成蓝色的噬菌斑。
替换型载体
• λ噬菌体的中央部分有一个可以被外源插入 的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。
从而能产生出大量的子代噬菌体颗粒。 • 使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒
λ噬菌体载体
1 λ噬菌体的分子生物学概述 2 λ噬菌体载体
1 λ噬菌体的分子生物学概述
• λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分 子，长48 502bp，两端各有12个碱基的5` 凸出黏性末端是互补的。进入细胞的λDNA 通过两端的黏性末端环化。可用来构建柯 斯质粒。
λ- 噬菌体及质粒载体
——郭苋 2014212346
噬菌体的一般生物学特性
• 依赖于寄主细胞存活。脱离了寄主细胞后既不能 生长也不能复制。
• 基本功能： • 保护自己的核酸分子（DNA或RNA）免遭环境化
学物质的破坏 • 将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞 • 经被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，
注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA 大小只能： 38kb ~ 52kb。 体外包装：λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白
λ噬菌体载体的良
• 围绕三个目的进行： • 设计可对重组体分子作正选择的克隆载体， • 构建可方便的通过转录作用制备外源DNA
插入序列之RNA探针的克隆载体 • 发展可使插入的真核cDNA与β-半乳糖苷
• λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其 生活周期。
λ噬菌体基因组编码基因区域
• 左侧区：自基因A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋 白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因。
• 中间区：介于基因J与基因N之间，这个区又称为非 必要区。本区基因与保持噬菌斑形成能力无关，但 包括了一些与重组有关的基因（redA 和redB）。以 及整合到大肠杆菌染色体中去的int基因。和把原噬 菌体从寄主染色体上删除出去的xis基因。
质粒载体的优缺点
• 质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源 蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。
• 1.与外源DNA重组操作简便； • 2.外源DNA在质粒载体中相对较稳定， • 3.质粒DNA的制备和纯化方便，快速简单，所以
得到广泛应用。
• 缺点： • 1.它容纳外源DNA片段有限，通常最多为15kb左
replicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂 而传给后代。
• ③质粒对宿主生存并不是必需的，某些质粒携带的基因
功能有利于宿主细胞的特定条件下生存。
质粒载体的种类
• 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为 载体。人工构建的质粒可以集多种有用的 特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗 生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素 基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含 有27种限制性内切酶的单一识别位点。
• 中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向 重复序列。因此当外源DNA插入时，一对 克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉， 从而有效的提高了克隆外源DNA片段的能 力。
λ噬菌体载体的特点
(1)筛选简便； (2)可克隆的片段大，最大可达23 kb，
而质粒最大仅10 kb左右； (3)转化效率高。λ噬菌体载体是主要用于cDNA构建， 也经常用于外源目的基因的克隆。