标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量
一、标准曲线
一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法
1、凯氏定氮法
2、双缩脲法
3、Folin-酚试剂法
4、紫外吸收法
5、考马斯亮蓝法
三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
（一）、试剂：
1、考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H
3PO
4
，
加蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝
G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H
3PO
4。
2、标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：
1、722S型分光光度计使用及原理
2、移液管使用
（三）、标准曲线制作：
1、
2、以A
595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、
40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A
595nm
=a×X( )+6
一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测围），依照操作步骤1操作，
测出样品的A
595nm
，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A
595nm 值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A
595nm
值太大，
可以稀释后再测A
595nm
值，然后再计算。
（五）、注意事项：
1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。
药品的配制（磷酸缓冲液的配制）
一、药品的配制步骤
（一）、实验准备：
1、准备所需的药品和玻璃仪器。
2、洗涤。
（怎样洗涤算干净？）
（二）、计算：
1、百分比浓度计算：
1)、G/V比
例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水。
2）、V/V比：
例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X, X=75ml。
取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水。
乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100 ml，200 ml混合。
3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。
2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。
1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml。
M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩尔数=G（g）/摩尔质量2）、0.1mMNaCl配100ml
mM=毫摩尔数/体积（L）称取NaCl 0.1×0.1×40=0.4g
毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量
3）、0.1uNaCl配100ml
mM=微摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg
微摩尔数=G（ug）/摩尔质量称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug
3、混合溶液配制的计算：
如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制。
注意：1、分别标定体积计算
2、分别配制再混合，但总体积不能为100ml
（三）、标量：
1、根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器，如量筒或移液
管。
2、电子分析天平的使用。
（四）、溶解：
1、根据药品配置要求选择溶剂。
蒸馏水，双蒸水，无离子水等。
2、只能用烧杯溶解。
注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤
烧杯三次左右，直到洗涤干净。
小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根据分子式和所学的常识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）。
如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解，但pH应在被要求的围。
3、加热促进溶解，但注意应在配制的围有的药品还需水溶加热较好。
如:配0.1%
的淀粉，水裕加热（温度在80-90。
C），过量会糊化。
（五）、定容：
1、用容量瓶定容；
2、用玻璃棒引流或用小漏斗；
3、用溶剂加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。
要求刻度与液体凹面相切
为止（眼睛可视）；
4、上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可。
(注意不再定容了，防止溶液漏掉。
) （六）、装入试剂瓶，贴上标签。
标签应注明以下容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等。
（七）、清理实验场所。
磷酸缓冲液（phosphate buffer）
按照下表所给定的体积，混合 1 mol/L 的磷酸二氢钠（单碱）和1mol/L 磷酸氢二钠（双碱）贮液，获得所需pH的磷酸缓冲液。
配制1 mol/L 的磷酸二氢钠（NaH2PO4•H2O）贮液：溶解138g于足量水中，使终体积为1L;1mol/L 磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液:溶解142g
于足量水中使终体积为1L。