疯牛病(TSE)检测的研究进展Ξ曾　明,漆文革3综述　雷殿良,李德富审校(中国药品生物制品检定所,北京　100050)摘　要:近年来,对TSE检测的研究发展非常迅速。

尽管朊病毒的分类本质尚不明确,但一些生物学特性已有研究,如传染性、抵抗力等,其检测技术包括:早期利用宿主动物牛或转基因小鼠的生物学方法;有多种免疫诊断方法可区分正常和异常的朊病毒蛋白,欧盟验证了三种免疫诊断方法,瑞士Prionics公司的免疫印迹法、爱尔兰En fer Scientific公司的E LIS A法和法国CE A和英国Bio2Rad公司开发的夹心免疫法,三种检测方法准确性为100%,因此,欧盟授权这三种检测方法用于欧洲检测疯牛病,此外,基于免疫荧光方法和毛细管免疫电泳的方法也有应用;研究人员还尝试通过对TSE感染过程中出现的相关蛋白、朊病毒的形态变化的检测来诊断TSE,也有针对TSE发病过程中,异常朊病毒蛋白在脑部出现聚集,采用不同手段用以诊断;在体外模拟感染性PrP(Sc)引起正常细胞表面蛋白PrP构象改变的过程也应用于TSE的检测。

对潜伏期的诊断试剂研究正在进行中,但目前并未取得满意的结果。

对朊病毒污染生物制品的可能性进行评估非常必要,对生产过程的监测非常重要。

相信未来3～5年将开发出高敏感性、高特异性和使用方便的TSE诊断方法。

关键词:疯牛病;TSE;检测中图分类号:S858.23 文献标识码:A 文章编号:100525673(2002)20320058204 在过去几年中,介入TSE诊断领域的公司急剧增加,主要原因在于潜在的巨大市场利润,一方面是对牛群是否感染的检测,欧盟要求对所有30月龄以上的牛进行检测;另一方面是对生物制品,主要是血液制品的检测,也包括疫苗生产原材料如小牛血清的检测。

基于投入力度的增加,TSE检测的研究发展非常迅速,相信在未来几年,多种敏感且特异的诊断方法将广泛应用。

现将其研究进展作一简要综述。

1　几个与疯牛病相关的名词Transmissible spongiform encephalopathy(TSE)可传播海绵状脑炎,由朊病毒引起的一类进行性、不可治愈的致死性疾病的统称,主要特征为痴呆,验尸时脑部有空洞;当一种哺乳动物食用另一种哺乳动物的脑或脊髓时可传播。

Mad cowldisease:疯牛病,TSE的俗称。

Prion:朊病毒,新型感染因子,通过链式反应摧毁神经细胞的感染性蛋白。

Creutz feldt2Jakob disease(C JD):克2雅氏病,发生于人的、自发的TSE。

Variant creutz feldt2Jakob disease(vC JD):新型克2雅氏病,食用污染牛肉而发生于人的TSE。

Bovine spongiform encephalopathy(BSE):牛海绵状脑炎,发生于牛的TSE。

Scrapie:羊骚痒病,发生于羊的TSE。

Chronic wasting disease(CW D):慢性消瘦疾病,发生于鹿或麋鹿的TSE。

2　TSE病原体的特点〔1,2〕1996年报道,认为新型克雅氏病(vC JD)来源于BSE,引起人们对通过食用污染的肉类而由牛到人种间传播的关注,有实验表明BSE和vC JD的病原体是一致的。

TSE为非传统意义上的病原体,数十年的研究已为我们提供了大量的信息,但仍有几个关键性的问题并未解决,如病原体的分类本质(如病毒/朊病毒/细菌/或其他;传播途径;最小感染量;)。

对TSEs病原体的解释包括感染性蛋白(朊病毒理论);非传统/慢病毒或细菌;自身免疫学说等;最为广泛接受的是朊病毒学说,即一种新型的无核酸感染性蛋白粒子引起的,PrP(朊病毒蛋白)是一种正常细胞蛋白构象改变的类型,一般宿主中不存在。

正常和异常蛋白的差异见表1〔1〕。

在实验动物中去除PrP基因可使小鼠完全抵抗感染。

病原体的传播能力受多种因素的影响,包括:途径、剂量、种属和中间屏障的有无;如脑内途径比静脉的感染性高10Ξ江西民星集团,南昌　330046作者简介:曾明(19662),男,博士,副研究员,主要从事微生物学与免疫学工作。

倍,而种间屏障则可减少1000倍,朊病毒在动物缩主间传播时可进行修饰,所以,一羊骚痒型在通过牛的传递后可对人产生威胁。

潜伏期长短取决于感染途径,可有数年和数月不等。

表1　朊病毒蛋白PrP的正常和异常类型特点对比〔1〕正常PrP 异常PrP 称为PrPsen或PrPc称为PrPres或PrPsc对蛋白酶敏感对蛋白酶相对不敏感与动态平衡相关与TSEs相关,推测为其感染因子在几种组织和细胞类型中发现脑、中枢神经组织和其他非神经组织细胞表面糖蛋白大型聚集体和淀粉样纤维可溶于温和清洁剂不可溶于温和清洁剂大多为螺旋结构大多为折叠结构自然蛋白有神经毒性 一般来说,TSE病原体对一系列物理和化学方法具有强抵抗力,干热(160℃,24小时无影响;360℃1小时后有感染能力),高压灭菌(126℃1小时后仍有感染性);抗UV和碘照射;适应广泛的pH范围(2～10);抗酒精以及酚类消毒剂。

3　首次有诊断意义的突破性研究最早应用的生物学方法为,将所怀疑已感染的动物材料接种至正常宿主动物,若干月或年之后,出现结果,显然这一方法不可能在实际诊断中应用。

1997年,加利福尼亚大学的学者建立了一株超表达小牛朊病毒蛋白PrP的转基因小鼠〔3〕。

正常小鼠对于BSE有一定抗性,加入小牛PrP基因后导致小鼠不仅敏感,甚至比自然宿主—牛还要敏感,转基因小鼠感染后几个月即死亡,而牛一般几年出现死亡。

这一研究的意义显然不仅仅在于提供了一种较为快速的检测方法,同时为研究BSE提供了重要实验手段,并且可确定感染牛组织中较为精确的朊病毒浓度。

4　免疫学诊断TSE诊断的实际应用需要更加快速并且可同时检测大量样本的方法,目前有多种免疫诊断方法可区分正常和异常的朊病毒蛋白,可以满足这一需求。

欧盟验证了三种免疫诊断方法,瑞士Prionics公司的免疫印迹法、爱尔兰En fer Scientific公司的E LIS A法和法国CE A和英国Bio2Rad公司开发的夹心免疫法〔2,4〕验证研究包括检测300份感染BSE牛脑组织样本,1000份来自正常牛样本,结果表明,三种检测方法准确性为100%,无假阳性和假阴性,因此,欧盟授权这三种检测方法用于欧洲检测疯牛病。

Pronics公司的Pronics Check法采用Western blot 法检测朊病毒蛋白,全程需要24小时,自1999年初已为瑞士和英国授权用于牛的过筛检测,并可对处于潜伏期动物进行BSE检测。

其推荐使用的Invit2 rogen公司生产的蛋白电泳凝胶NuPAGE最近已获美国专利。

Prionics公司最近与R oche公司签定了协议,一方面推广其产品,另一方面合作开发对活动物进行血液检测的试剂,鉴于血液中所含朊病毒少,这一研究预计需要较长时间。

CE A/Bio2Rad公司的Platelia试剂采用夹心免疫法,约4小时出结果,尤其适用于有大量样本的情况下,该产品预计将有每月1百万的生产量,目前在德国等欧洲国家的销售良好。

该方法最近与传统接种动物的方法平行对比,检测感染BSE牛脑组织稀释样本,结果表明至少其准确性良好,有可能用于检测处于潜伏期的标本。

目前该公司同样着力于对血液标本检测的研究和开发。

En fer的产品为E LIS A法,24小时可出结果,通过采用自动化仪器可用于高通量检测。

目前主要在爱尔兰使用,用于检测宰杀后人用牛脊髓和感染BSE牛的检测。

其他一些公司也在着力开发免疫诊断试剂。

如EGG Wallac的基于免疫荧光方法的Delfia试剂,敏感性非常高,也经过了欧盟的评价,因结果不理想而未获欧盟授权使用,但英国农渔食品部(M AFF)同意将其用于检测英国的牲畜以进行确证,并推荐由欧盟进行再次评估。

目前欧盟正考察其他5种检测方法,并欢迎其他研究者的检测方法。

M AFF对一种毛细管免疫电泳(ICE)方法颇感兴趣,它可通过血样检测羊骚痒病和类似的麋鹿慢性消瘦病,这一方法是朊病毒与荧光标记的人工合成的正常朊病毒蛋白竞争结合抗体,然后通过毛细管免疫电泳分离和分析,如果能应用于牛将是一重大突破,然而BSE和羊骚痒病有很大差异,并且人们尚不了解血流中最终和感染各阶段有多少朊病毒存在。

5　其他方法研究人员还尝试通过对TSE感染过程中出现的相关蛋白、朊病毒的形态变化的检测来诊断TSE。

德国的研究人员发现〔5〕,朊病毒对神经细胞产生毒性的原因在于引起神经细胞的凋亡,这一过程中出现的特异性相关蛋白可作为检测的目标,脑脊液中的142323蛋白被证明是朊病毒引起神经细胞凋亡的标记,目前已开发一种敏感方法检测这一蛋白,有可能用于诊断。

此外针对TSE发病过程中,异常的朊病毒蛋白在脑部出现聚集,也有研究者采用不同手段用以诊断疯牛病。

G iese等〔6,7〕应用共聚焦双染色荧光相关光谱的方法,开发了一种对脑脊液标本进行检测的高敏感诊断方法,这一技术甚至可以检测到单一分子。

首先用染料标记的特异抗体与朊病毒蛋白聚集体结合,得到高荧光强度的靶位,然后进行测量和分析,在这一系统中可检测约2m ol/L浓度的PrP蛋白,比免疫印迹法还要敏感,可为TSE诊断提供快速、特异的检测方法。

S oborio等〔8〕在体外模拟感染性PrP(Sc)引起正常细胞表面蛋白PrP构象改变的过程,应用一种类似于PCR扩增的方法,少量PrP(Sc)与PrP共同孵育形成聚集体,超声波破碎成多个较小单位,继续形成新PrP(Sc),最终在样本中获得97%以上的蛋白酶抗性PrP。

这一方法可用于诊断当前组织和体液中的朊病毒感染因子,也可能为确定PrP(Sc)复制是否能在体外引起感染提供帮助。

6　潜伏期及死亡前(Pre2mortem)诊断〔2〕尽管各公司都宣称或正尽力开发对潜伏期的诊断试剂的研究,但目前并未取得满意的结果。

任何用于潜伏期检测的方法都应该通过用已故意感染BSE的动物进行确证,如果检测出阳性,下一步则确定感染的那一阶段可获得可靠结果。

1998年,兽医实验室的科学家们故意用BSE感染200头牛,每三个月杀感染和对照组的牛,取组织样本冻存,这是迄今为止唯一必须用于潜伏期诊断评价的生物材料。

目前用于死动物脑组织的检测方法难以应用于活动物血液标本,但其他方面的研究也有一些进展,如瑞士科学家研究显示,朊病毒可与血液中血纤维蛋白溶酶原结合,对于这一结合蛋白的检测可能作为血检的基础。

目前有多家公司正着力开发这类产品,如Caprion公司正探索以形态漂移(Shape2shift2 ing)蛋白作为诊断目标。

Wadsw orth JD等〔9〕应用磷酸钠沉淀组织中PrP(Sc),并通过增强化学发光提高了免疫印迹的敏感性,这一方法用以调查和分析PrP(Sc)蛋白4例vC JD病人组织中的分布情况,结果表明,除脑组织外,扁桃体,脾和淋巴节都为阳性,其中扁桃体一致表现为最高的浓度,同时在视网膜、视神经上检出PrP(Sc),并在其中一例的直肠、肾上腺、胸腺中检出PrP(Sc),阑尾和血液用本方法检测均为阴性。