项目
分析
血液样品的处
分层____→样品处理完成 理
凝胶色谱柱的 放一个与凝胶柱垂直的日光灯→直接检查； 加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖或红色葡聚糖，若
装填
色带均匀、狭窄、平整→装填成功
血红蛋白的分 血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓
离
慢流出→分离成功
知识点一 分离蛋白质的基本方法原理 1．利用凝胶色谱法分离蛋白质时，蛋白质洗脱出来的顺序是( ) ①相对分子质量最大的 ②相对分子质量最小的 ③相对分子质量适中的 A．①②③ B．③②① C．①③② D．②①③ 2．凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白 质都可以用此方法进行分离，能分离的蛋白质分子之间必须( ) A．具有相同的相对分子质量 B．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子 C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子 D．具有不同的相对分子质量 知识点二 分离蛋白质的实验操作 3．对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作，不正确的是( ) A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐 B．让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝 胶面
C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液洗脱瓶 开始洗脱 D．待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，每5 mL收集一管，连续收集流 出液 4．在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程的分析无误的是 ( ) A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐 B．洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的 效果 C．洗涤过程选用0.1%的生理盐水 D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质 答案 一、1.分配色谱法 相对分子质量 蛋白质 大于 外面 较快 小于 较慢 2．(1)酸 碱 pH (2)1～2 使用比例 在不同pH范围内使用 3．(1)带电粒子 电场 迁移 多肽 核酸 正电 负电 与其所带电 荷相反 (2)带电 大小 形状 不同的迁移速度 (3)①琼脂糖凝胶 ②聚丙烯酰胺凝胶 二、1.(1)去除杂蛋白 (2)②离心 ③血浆 ④洗涤 2．释放 (1)蒸馏水 甲苯 (2)涨破 3．(1)①离心管 离心 (2)血红蛋白
③将滤液置于分液漏斗中，静止片刻后，分出下层的红色透明液体，即 为血红蛋白溶液。 (2)目的：使________与大部分杂质分离开，便于后续纯化。 (3)离心后试管中的溶液分为4层，最上面的一层是甲苯层，第二层是脂 溶性物质沉淀层，第三层是血红蛋白水溶液层，最下层是杂质沉淀层。 4．粗分离——透析 (1)原理：______能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。 (2)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。 (3)目的 ①除去样品中相对分子质量较小的杂质。 ②用于更换样品的缓冲液。 三、纯化蛋白质 1．凝胶色谱柱的制作 (1)取长40 cm，内径为1.6 cm的________，两端需用砂纸磨平。 (2)柱底部制作：打孔→挖出________→安装移液管头部→覆盖尼龙网， 再用100目尼龙纱将________上部包好。 (3)柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。 (4)将上述三部分按相应位置组装成一个整体。 2．凝胶色谱柱的装填 (1)计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量
↓ (2)凝胶________：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬液 ↓ (3)________：将色谱柱垂直固定在支架上 ↓ (4)________：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内 ↓ (5)________：用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)洗涤平衡凝胶12 h， 使凝胶装填紧密 3．样品的加入和洗脱 (1)调整缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，调整缓冲液与凝胶面 ________
血红蛋白的提取和分离
目标导航 1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。2.理 解缓冲液的组成和作用机理。3.体验提取生物大分子的基本过程和方 法。
一、分离蛋白质的基本方法原理 1．蛋白质的分离方法——凝胶色谱法 凝胶色谱法也称做___________的有效方法。
4．(1)透析袋 三、1.(1)玻璃管 (2)凹穴 橡皮塞 2．(2)溶胀 (3)固定 (4)装填 (5)洗涤平衡 3．(1)平齐 (2)滴加 (4)缓冲液面 (5)洗脱 四、1.洗涤次数不能过少；低速、短时离心 2．沸水浴法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物和 气泡 3．装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流 4．红色区带均匀一致地移动 五、1.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 2.明显 对点训练 1．C [分子很大，完全不能进入凝胶内的任何孔隙的蛋白质洗脱出来 的时间最短；分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小相应部分的 蛋白质，洗脱出来的时间次之；分子很小，能进入分子筛全部孔隙内的 蛋白质，洗脱出来的时间最长。] 联想 凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法， 相对分子质量很小，能进入分子筛的全部孔隙，运动速度最慢，路程最 长；相对分子质量较大的，不能进入凝胶颗粒内，运动速度最快，路程 最短。所以，蛋白质可以按不同顺序洗脱出来。 规律链接 凝胶色谱中分子彼此间较易分开的原因 在凝胶色谱中会有三种情况：一是分子很小，能进入分子筛的全部内孔
相对分 直径大小
子质量
运动方式
运动速 运动 洗脱
度
路程 次序
____凝胶颗粒空
先从凝
大
隙直径，被排阻 垂直向下移动 ____ 较短 胶柱洗
在____
脱出来
____凝胶颗粒空 垂直向下移动，
小
隙直径，可以进 无规则扩散进入 ____
入颗粒内部
凝胶颗粒
2.缓冲液的作用和组成
后从凝 较长 胶柱洗
脱出来
(1)作用 在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界________和________对溶液 ________的影响，维持pH基本不变。 纯水的pH因加入少量的强酸或强碱而发生很大变化。然而，1滴浓盐酸 加入到1 L CH3COOH—CH3COONa混合溶液或NaH2PO4—Na2HPO4混 合溶液中，[H＋]的增加不到百分之一(从1.00×10－7 mol/L增到1.01×10 －7 mol/L)，pH没有明显变化。 (2)组成 缓冲溶液通常由________种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的 ____________就可以制得________________________的缓冲液，其类型 主要有3种： ①弱酸及其对应盐，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。 ②多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如 NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。 ③弱碱及其对应盐，如NH3·H2O—NH4Cl。 3．电泳 (1)概念 电泳是指____________在________的作用下发生________的过程。许多 重要的生物大分子，如________、________等都具有可解离的基团，在 一定的pH下，这些基团会带上________或________。在电场的作用 下，这些带电分子会向着________________的电极移动。
只需1～2 h。这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生 物，排出胶粒内的空气。 4．凝胶色谱柱的装填 在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 (1)在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质 的洗脱次序，降低分离效果。 (2)在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现 象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。 5．蛋白质的分离 滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。根据 红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。 4．D [洗涤红细胞的目的是去除血浆中除血红蛋白以外的杂蛋白；洗 涤时离心速度过大，时间过长，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果； 洗涤过程选用0.9%的生理盐水。]
(2)原理 在同一电场下，由于各种分子________性质的差异及分子本身 ________、________的不同，使带电分子产生________________，从而 实现样品中各种分子的分离。 (3)常用方法 ①____________电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电 场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大小和形状不同而不 同，从而得以分离。 ②________________电泳 加入SDS作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；与各种蛋白 质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白 质原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率 完全取决于分子的大小。 二、粗提取血红蛋白 1．红细胞的洗涤 (1)目的：____________，以利于后续步骤的分离纯化。 (2)过程 ：为防止血液凝固，需在采血器中加入抗凝血剂柠檬酸钠
：500 r/min，离心2 min，这样做的目的是防止红细胞与白细胞一同沉 淀，达不到分离效果
：用胶头吸管吸去上层黄色血浆
：向盛有暗红色红细胞液体的烧杯中加入五倍体积的生理盐水，缓缓搅 拌10 min
：直至上清液中没有黄色，表明红细胞已经洗涤干净，否则需重复洗涤 (3)操作提示：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要，洗涤次数少， 无法除去血浆蛋白，离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀， 达不到分离效果。 2．血红蛋白的____ (1)方法：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加______到原血液的体积，再 加40%体积的______，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。 (2)目的：使红细胞吸水____，血红蛋白释放出来。 (3)原理：渗透作用。 3．分离血红蛋白溶液 (1)方法 ①将搅拌好的混合液转移到__________中，以2 000 r/min的速度____10 min。 ②将离心管中的液体部分用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。
隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适 中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。三类分子彼此间较易 分开。 2．C [若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况 下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种 分子，在凝胶床中的分布情况是不同的，分子较大的只能进入孔径较大 的那一部分凝胶。] 3．C [打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，在 用同样的方法小心加入适量的20 mmol/L的磷酸缓冲液，然后连接缓冲 液洗脱瓶开始洗脱。] 规律链接 血红蛋白提取与分离过程中的注意事项 1．红细胞的洗涤 (1)离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细 胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。 (2)重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除 血浆蛋白。 2．血红蛋白的释放 (1)蒸馏水的作用：使红细胞的细胞膜和核膜破裂。 (2)甲苯的作用：溶解细胞膜。 3．色谱柱填料的处理 为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常