一．概述1.维生素B2片含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)为流动相；检测波长为444nm。
理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。
1.2测定法避光操作。
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于维生素B2 10mg)，置500ml量瓶中，加盐酸溶液(1→2)10ml，振摇使维生素B2 溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素B2对照品约10mg，同法测定。
按外标法以峰面积计算，即得。
1.3本品含维生素B2计算，应为标示量的90.0% ～110.0%。
2. 维生素B2片溶出度测定：照溶出度与释放度测定法（通则0931第二法）测定法避光操作。
取本品，以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，经20分钟时，取溶液10ml，滤过，取续滤液，照紫外-可分光光度法（通则0401)，在444nm的波长处测定吸光度，按C17H20N4O6的吸收系数()为323计算每片的溶出量。
限度为标示量的75%，应符合规定。
3. 维生素B2片有关物质测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
色谱条件照含量测定。
避光操作。
取本品的细粉适量（约相当于维生素B2 10mg)，置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（1→2)5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.75倍(1.5% ) ，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（3.0% )。
供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积0.025倍的色谱峰忽略不计。
4.工艺处方组成5、仪器基本情况：6.相关术语：6.1准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。
一般用回收率（%）表示。
回收率限度应在98%～102%之间。
6.2精密度系指在规定的条件下同一份均匀的供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。
6.3线性系指在设计的范围内，测定响应值与试样中被测物质浓度呈比例关系的程度6.4范围系指分析方法能达到一定精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度或量的区间。
6.5检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。
6.6耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。
二.验证目的通过验证以确认所采用的方法适合于维生素B2片的测定。
根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行维生素B2片检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
三.验证依据中国药典2015年版二部中国药典2015年版四部9101《药品质量标准分析方法验证指导原则》四.参考文件1、验证管理规程2、验证总计划3、SIL-20A高效液相色谱仪操作维护保养规程4 UV-1800紫外可见分光光度计操作维护保养规程5、中国药典2015年版6、变更控制规程7、偏差控制规程XXXX五.验证步骤1. 维生素B2片含量分析方法验证1.1系统适应性试验1.1.1色谱条件①固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；②检测器：紫外检测器，检测波长444nm；③流动相：0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)④流速：1.0mL/min。
⑤柱温：30℃⑥进样量：20μL。
照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.1.2系统适用性试验溶液：取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。
溶解并稀释制成每1ml中各约含20µg的溶液，1.1.3取系统适用性试验溶液20μL注入液相色谱仪。
1.1.4判定标准：理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。
1.2维生素B2片含量分析方法线性验证1.2.1溶液配制1.2.1流动相配制0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)为流动相1.2.2处方量辅料配制精密称定淀粉约307mg、糊精约240mg、硬脂酸镁约3mg、混合。
此混合辅料约为10片维生素B2（50mg）所需的辅料共约550 mg。
1.2.3样品溶液配制精密称定维生素B2对照品约25mg，置250ml容量瓶中，加入处方量混合辅料275mg，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,取续滤液，制成浓度为100µg /ml的溶液。
按80%、90%、100%、110%、120%的倍数稀释，精密量取8ml、9ml、10ml、11ml、12ml分别置50ml容量瓶中，加水配置成浓度为16µg /ml、18µg /ml、20µg/ml、22µg /ml、24µg /ml的溶液。
1.2.2测定精密量取经微孔滤膜过滤后各不同浓度稀释液20μl，注入液相色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图。
按外标法以峰面积计算。
1.2.3判定标准：维生素B2在16µg /ml至24µg /ml的浓度范围内，维生素B2峰面积成线性且相关系数R≥99.8%。
1.3维生素B2片含量分析方法精密度验证1.3.1流动相配制见维生素B2片含量分析方法线性验证项下。
1.3.2样品溶液配制取维生素B2片20片（XXXX生产），精密称定，计算平均片重，研细，精密称取样品适量（约相当于维生素B2 10mg）置500ml量瓶中，盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过制成20µg /ml的溶液,取续滤液作为样品溶液。
1.3.3 测定精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，连续6次，得到维生素B2峰面积，计算维生素B2峰的S rel。
1.3.4判定标准：维生素B2峰面积的S rel≤2.0%。
1.4维生素B2片含量分析方法准确度验证1.4.1流动相配制、处方量辅料配制见维生素B2片含量分析方法线性验证项下。
1.4.2样品溶液配制精密称定维生素B2对照品约25mg，置250ml容量瓶中，加入处方量混合辅料275mg，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,取续滤液，制成浓度为100µg /ml的溶液。
按80%、100% 、120%的倍数稀释,精密量取续滤液8ml、10ml、12ml，分别置于50ml容量瓶中，加水配制成浓度为16µg /ml、20µg /ml、24µg /ml的测试溶液。
1.4.3测定精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，得到维生素B2峰面积。
通过线性方程计算维生素B2浓度。
用测得浓度和实际浓度之比计算回收率。
1.4.4判定标准：回收率限度应在98%-102%之间，回收率的S rel≤2.0%。
1.5维生素B2片含量分析方法范围验证1.5.1数据记录及结果计算依据1.2线性，1.3精密度，1.4准确度，确定高效液相色谱法符合《中国药典》2015版维生素B2峰含量的范围一般为测定浓度的范围。
1.5.2判定标准：含量的范围一般为测定浓度的 80%〜120%。
1.6维生素B2片含量分析方法专属性验证1.6.1流动相配制、溶剂Ⅰ配制、处方量辅料配制见维生素B2片含量分析方法线性验证项下。
1.6.2溶液配制1.6.2.1供试品溶液：取维生素B2片（XXXX生产）20片，精密称定，计算平均片重，研细，精密称取样品（约相当于维生素B2 10mg），置500ml量瓶中，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过制成20µg /ml 的溶液,取续滤液作为供试品溶液。
1.6.2.2对照品溶液：精密称取维生素B2对照品10mg，置500ml量瓶中，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,制成20µg /ml的对照品溶液。
1.6.2.3空白溶液：在500ml量瓶中，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇，再加水稀释至刻度，摇匀,作为空白溶液。
1.6.2.4阴性溶液：按照片剂配方，加入处方量混合辅料55mg，置250ml量瓶中，加盐酸溶液（(1→2)10ml），加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,续滤液，作为阴性溶液。
1.6.3测定精密量取经微孔滤膜过滤后的供试品溶液、对照品溶液、空白溶液、阴性溶液各20μl，注入液相色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图。
1.6.4判定标准：维生素B2对照品溶液与样品溶液主峰保留时间一致，空白溶液与阴性溶液在主峰保留时间处应为平直基线，无吸收峰。
1.7维生素B2片含量分析方法耐用性验证1.7.1改变流动相比例1.7.1.1色谱条件①固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；②检测器：紫外检测器，检测波长444nm；③流动相：0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(80∶15∶5)为流动相④流速：1.0mL/min。
⑤柱温：30℃⑥进样量：20μL。
照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.7.1.2系统适用性试验溶液：系统适用性试验溶液：取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。
溶解并稀释制成每1ml中各约含20µg的溶液，1.7.1.3取系统适用性试验溶液20μL注入液相色谱仪。
1.7.2改变柱温及流动相1.7.2.1色谱条件①固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；②检测器：紫外检测器，检测波长444nm；③流动相：0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)为流动相④流速：1.0mL/min。