第一部分PCR及其相关的技术1. P C R 技术原理PCR技术实际上是DNA体外合成放大反应。

其基本原理是根据细胞分裂中DNA的半保留复制机理。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。

①模板DNA的变性: 模板DNA经加热至94 - 95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

②模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40-70℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

2. PCR反应体系缓冲液；模板DNA；引物；脱氧核糖核苷三磷酸（dA TP dTTP dGTP dCTP)；TaqDNA 聚合酶；Mg2+3. 引物设计原则①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%，两个引物的Tm值应基本接近(<5 ℃)，且以在55 – 65℃为好。

⑤碱基要随机分布。

⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补（发夹结构）。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补（引物二聚体），特别是一引物的3…端不能结合到另一引物。

⑧引物5′端可以修饰（标记、酶切位点等）。

⑨引物3′端不可修饰，最好选G/C，一般不放A。

⑩引物3′端要避开密码子的第3位。

4. PCR的特点（1）灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌（2）简便、快速一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析（3）对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA5. RT-PCR及其应用RT-PCR指逆转录PCR, 是指从RNA或mRNA直接扩增获得目的DNA片段的过程.主要应用：1）RNA序列分析2）基因表达研究3）遗传病诊断6.荧光定量PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。

7.荧光定量PCR定量原理及计算方法反应最初，虽然产物是指数增长,但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加.当累积了足够的扩增产物，可以产生可检测的荧光信号时，这个循环数叫初始循环数，即CT。

由于CT值处于指数期内，这时的反应成份不会抑制扩增反应进行，因此荧光定量PCR 结果是可靠的，可以准确地反应体系中模板的初始量。

如果产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距由等式“2n=稀释倍数“决定；n为阈值线上扩增曲线之间的循环数（CT的差值）例如：10倍稀释的DNA样品，2n=10 因此n=3.32，即CT值相差3.32个循环8. 荧光定量PCR的应用（1）实时监测产物量，计算初始模板量（2）基础研究的基因表达分析研究（3）临床病原体检测病人体液中目标基因的检测：病毒,寄生虫,细菌市场上有各种开发好的试剂盒（4）食品卫生检疫a.转基因食品的检疫：根据转入基因的特异性区段设计探针b.食品中病原微生物的检测第二部分蛋白质的分离纯化1.蛋白质分离纯化的依据①蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质的肽链数目及每条肽链的氨基酸残基数目，透析、超过滤、分子筛层析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等就是依据蛋白质分子大小进行分离纯化蛋白质的；②蛋白质的带电特性蛋白质肽链的氨基末端、羧基末端、酸性氨基酸残基的侧链R基以及碱性氨基酸残基的侧链R基等，在不同的pH条件下会带有不同的电荷，等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳等都是以此为依据来分离纯化蛋白质；③蛋白质的溶解特性大多数蛋白质在水溶液中会形成稳定的胶体溶液，易溶于稀酸、稀碱或稀盐等，当破坏胶体稳定存在的条件时，蛋白质会沉淀析出，硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离等均依据此原理；④蛋白质的变性与复性：蛋白质在一定的物理化学条件下会失去原有的空间结构、生物学功能以及部分理化特性等称为变性，在变性条件不剧烈，某些蛋白质在除去变性条件后会恢复原有的空间结构和生物学功能即为复性。

例如，采用尿素变性复性的方法从包含体中纯化原核表达蛋白；⑤蛋白质的结晶：天然蛋白质在一定的物理化学条件下，浓度达到过饱和状态时就会结晶析出，如从鸡蛋中纯化溶菌酶等就可以采取结晶与再结晶的方法；⑥蛋白质分子表面的特性：蛋白质分子表面疏水氨基酸残基的数目、比例以及分布区域不同，因此它们与吸附剂的吸附作用力不同，蛋白质的吸附层析就是依据此原理；⑦蛋白质的分子形状：不同的蛋白质具有不同的分子形状，因此其与特定的配基(或配体)具有专一的结合特性，如酶与底物、酶与其抑制剂或激活剂，抗体与抗原，凝集素与葡聚糖等，亲和层析就是以此为依据；2. 蛋白质分离纯化与鉴定的主要步骤（1）选择实验材料（2）实验材料的预处理（3）蛋白质的提取（4）蛋白质粗分级（5）蛋白质细分级（6）蛋白质的鉴定3. 蛋白质粗分级方法⏹硫酸铵分级沉淀⏹有机溶剂分级沉淀⏹超速离心⏹等电点沉淀⏹透析⏹超滤⏹蛋白质结晶⏹4. 蛋白质细分级方法⏹分子筛层析⏹离子交换层析⏹亲和层析⏹聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳、毛细胞电泳、等电聚焦电泳等5蛋白质鉴定的相关要素⏹蛋白质分子质量⏹等电点⏹氨基酸组成及其顺序⏹免疫特性⏹结晶特性⏹生物学功能6.实验设计大肠杆菌中表达的融合有组氨酸标签的绿色荧光蛋白的分离纯化(1)选择实验材料：大肠杆菌(含有His-GFP表达质粒)在液体LB培养基中培养，离心，除去LB培养基，收集菌体沉淀。

(2)实验材料预处理：用蛋白质提取缓冲液悬浮菌体，离心后收集菌体沉淀，再用蛋白质提取缓冲液洗涤菌体一次，用少量提取缓冲液悬浮菌体，冰浴条件下超声波破碎菌体，离心后的上清液即为绿色荧光蛋白粗提取液。

(3)蛋白质粗分级：将绿色荧光蛋白粗提取液装入透析袋中浓缩，透析除去小分子杂质。

(4)蛋白质细分级：使用镍亲和层析柱亲和纯化带有组氨酸标签的绿色荧光蛋白。

(5)蛋白质的鉴定：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定绿色荧光蛋白分子质量，使用荧光分光光度计测定绿色荧光蛋白荧光光谱等。

7．常用的分子筛层析凝胶⏹葡聚糖凝胶（Sephadex）⏹琼脂糖凝胶（Sepharose ）⏹聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P）⏹Sephacryl凝胶⏹Superdex凝胶⏹Superose凝胶⏹其他凝胶：多孔硅胶、多孔玻璃珠8．分子筛层析的原理凝胶颗粒内部呈网孔状结构，分子质量大的蛋白质难以进入凝胶颗粒内部，主要从凝胶颗粒的间隙里通过，所受阻滞作用小，所以大分子蛋白质迁移速度快，先流出凝胶。

分子质量小的蛋白质则容易进入凝胶颗粒内部，所受阻滞作用大，所以小分子蛋白质迁移速度慢，后流出凝胶，从而将分子质量大小不同的蛋白质分开。

9．离子交换层析原理：蛋白质是两性分子，在一定的pH条件下带有电荷，不同的蛋白质所带有电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。

这样，当蛋白质混合物流经带电凝胶时，电荷吸引作用小的蛋白质先流过，而电荷吸引作用大的蛋白质后流过凝胶，从而把不同的蛋白质分开。

10．吸附层析原理由于不同的蛋白质所含有的氨基酸的种类和数目不同，分子表面的极性氨基酸和非极性氨基酸的数目、分布区域不同，因此它与分子比表面积大的吸附剂间的相互作用力大小不同。

根据此原理对蛋白质进行分离纯化。

11．亲和层析原理：亲和层析是利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。

优点：一步得到高纯度的目标蛋白缺点：制备特定蛋白质的专一性配体较为困难；一种亲和层析介质只能纯化一种或一类蛋白，成本较高。

12．蛋白质的鉴定基本方法⏹蛋白质含量测定⏹蛋白质纯度鉴定⏹蛋白质分子质量及等电点测定⏹蛋白质氨基酸组成及顺序分析⏹蛋白质结晶与结构分析⏹蛋白质免疫印迹(Western-blotting)鉴定⏹蛋白质生物活性及功能测定第三部分蛋白质组学1．蛋白质组学概念♦蛋白质组(proteome)是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。

♦从蛋白质组的定义上就可以清楚看出，蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科之处在于它的研究是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的，它从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和阐明生命活动的基本规律。

2．蛋白质组学的难点（1）蛋白质组的多样性：基因组作为遗传信息的载体，无论在什么样的生长条件下，它是始终不变的，然而，对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的活动状态，蛋白质组是具有多样性的。

（2）基因与蛋白质不是一一的对应关系：一方面，人们已经发现有许多“拟基因”的存在，这些拟基因有和真基因相同的可读框，但却从不表达；另一方面，由于存在RNA水平上遗传信息的加工一mRNA编辑和蛋白质水平上遗传信息的加工一蛋白质剪接，许多蛋白质很难找到直接对应的可读框。

所以，要想找到一个生物体基因组的全部基因和相应的全部蛋白质是一个非常困难的任务。

（3）蛋白质组的动态性：♦一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变。

而作为新陈代谢的主要执行者的蛋白质组，在个体的生命活动中却总是变动不停。

因为蛋白质的稳定性要比核酸差得多，在制备的过程中可能会发生降解或丢失。

（4）蛋白质组的时空性：♦而在蛋白质组的研究中，不仅要考虑时间因素，更要考虑空间的影响。

首先不同的蛋白质分布在细胞的不同部位。

它们的功能与其空间定位密切相关。

要想真正了解蛋白质的功能，必须要知道蛋白质所处的空间位置。

其次，许多蛋白质在细胞里不是静止不动的，它们在细胞里常常通过在不同的亚细胞环境里运动发挥作用。

因此对于亚细胞蛋白质组学来说有两个难点：一是如何对细胞进行恰当的分级分离；二是如何区别亚细胞组成蛋白质和由于生理作用而在细胞不同区域进行运动的蛋白质。

3．蛋白质组研究核心技术♦蛋白质分离技术(如双向电泳和多维液相层析)；♦蛋白质鉴定方法(如氨基酸序列分析和质谱技术）♦生物信息学技术4．双向电泳第一向: 等电聚焦（IEF）：等电聚焦是利用蛋白质分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线形pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。

第二向:SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：SDS-PAGE电泳是根据SDS和还原试剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定的pH缓冲系统中的分离。