Protocol蛋白质纯化方法（镍柱）柱前操作1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min;2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质；3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体；4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱；平衡柱子（柱体积：V）7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）；8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？9. 3V BB;柱层析10.上样；11. 10V Washing Buffer（WB）；12. 6V Elute Buffer（EB);13.分管收集，每管1~2ml.各种缓冲液配方1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.91000mlNaCl: 58.44×4=233.76gTris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824gImidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g2. 8×CB: 400mM NiSO41000mlNiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.91000mlNaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.91000mlNaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g5. 6M 尿素1000ml尿素：60.06×6=360.36gNi柱纯化蛋白注意事项(2011-10-13 16:01:39)使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白，是我们大家再熟悉不过的实验操作了。
我们对整个操作的流程及注意事项，很可能是师从兄师姐那里获得的。
这些经验都是大家智慧的结晶。
同时，这也有一定的不足之处，那就是我们学习到的是局部，还有一些我们不常用或者基本不会接触到的面儿，那些知识我们应该从哪里掌握呢？给大家推荐一个办法，那就是参考那些大公司的实验手册。
一般像GE、Qia gen等知名公司，都有Ni柱柱材料的产品，因此关于柱材料的各种性质参数，以及使用方法和注意事项都有详细的说明。
下面我就列举一些我从这些实验手册里总结出来的一部分Tips，仅供参考。
1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等；2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原；4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；5.在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M）10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染；？？？Ni柱纯化His-tag蛋白质一非变性条件下抽提His-Tag蛋白质下列方法适用于从细菌中抽提通常含有连续6个组氨酸尾（His Tag Protein）的具有天然结构的可溶性重组蛋白质（NativeProtein）。
其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具有His-Tag结构，提供的层析方法可供参考。
1.样品准备1) 准备细胞，接种，诱导表达。
对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mM IPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。
收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。
2) 加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10% Glycerol）和PMSF。
PMSF用无水乙醇配制成200mM 储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF 见水分解，需要在使用前加入。
该步骤冰上操作。
3)将细胞悬浮起来，加入溶菌酶（工作浓度位0.2-0.4mg/ml，如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶），混匀，冰上放置30分钟，超声或匀浆破碎细胞。
该步骤冰上操作。
4)加入10%Triton X-100, 使Triton的终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15分钟，间或混匀）；冰上超声破碎细胞，同时降低粘稠度。
5)加入1M MgCl2，使MgCl2的终浓度为1mM，混匀。
加入DNase, 使DNase的终浓度为10mg/ml，混匀，室温放置10分钟。
？？6)5000转/分（20,000xg以上），4度离心15分钟以上。
取上清，置于冰上备用或-20度保存。
2．层析1) 将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗。
2)将样品（步骤2（6））加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。
3)层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右。
4)分别用5倍NTA体积的NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000 Buffer洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。
5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。
最为有效的方式是SDS/PAGE分析。
也可以用BBST的Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。
6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。
纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
附溶液配方：NTA-0 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol,NTA-20 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 20mM Imidazole(咪唑)NTA-40 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 40mM Imidazole(咪唑)NTA-60Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 60mM Imidazole(咪唑)NTA-80Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 80mM Imidazole(咪唑)NTA-100Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 100mM Imidazole(咪唑)NTA-200Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 200mM Imidazole(咪唑)NTA-1000 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 1000mM Imidazole (咪唑)二变性条件下从包涵体中纯化His-Tag的蛋白质有些蛋白质细菌或其他细胞中表达效率很高，但溶解性很差，通常形成包涵体。
这些蛋白质的溶解通常需要用盐酸胍或尿素。
与MBP和GST的亲和层析材料相比，NTA树脂可以在6M的盐酸胍存在的情况下与具有His Tag的蛋白质结合。
整个层析过程都是在有盐酸胍的条件下进行。
纯化后的蛋白质需要进行复性，正确复性的蛋白质才具有生物学活性。
下列方法（步骤4-5）用于从细菌中抽提含His-Tag位于包涵体变性蛋白质。
1．样品准备1)准备细胞，接种，诱导表达。
对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mM IPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。
收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。
2)加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10% Glycerol, 6M Guanidium HCl ）和PMSF。
PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入。
3)将细胞悬浮起来，冰上超声破碎细胞，降低粘稠度。
4)室温放置30分钟，间或混匀或用磁力搅拌。
5)15000转/分（20,000xg以上），4度离心15分钟以上。
取上清，置于冰上备用或-20度保存。
2．层析1)将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗。
2) 将样品（步骤2（5））加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。
3)层析用5倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右。
4)分别用5倍NTA体积GuNTA-20，GuNTA-40，GuNTA-60，GuNTA-100，GuNTA-500洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。
5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。
最为有效的方式是SDS/PAGE分析。
也可以用BBST的Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。
6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。
7)纯化的目标蛋白质需要复性，复性常用的手段可以参考有关手册确定的原则，根据蛋白质的特性来摸索具体的方案。