革兰染色法的原理
★渗透学说：与肽聚糖结构有关。 革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量高，酒精不易渗透， 而革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量少，脂类含量高， 酒精易渗透进入细胞内，将结合的结晶紫碘复合物 脱出。
★化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关。 革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫-碘结
合形成更大的复合物，不易被酒精脱出。 ★等电点学说：与细菌所带电荷有关。
实验三 革兰染色法
实验目的和要求
1. 理解革兰染色法的原理； 2. 掌握细菌涂片的制作； 3.掌握革兰染色的方法以及意义；
细菌形态检查方法 1. 不染色标本检查法 2. 染色标本检查法
（一）不染色标本检查
应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式 常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光法
压滴法
染色标本检查的基本程序
涂片－→干燥－→固定－→染色 ★涂片：接种环灭菌、平板取材、细菌涂布 ★干燥：自然干燥、热空气干燥 ★固定：通过火焰外焰三次 ★染色：初染、媒染、脱色、复固定
片
的
制
染色
作
镜检
革兰染色法（Gram染色）
染液组成： 结晶紫染液、卢戈碘液 95％乙醇、稀释复红
正染色法
负染色法
细菌染色的方法
单染法:采用一种染料染色,只能观察细菌 的形态和排列特征，不能观察细菌的染色 特性和进行鉴别。
复染法（鉴别染色法）:采用两种或两种以 上的不同染料进行先后染色，使不同种类 的细菌、同种细菌的不同结构，分别染上 不同的颜色，以便鉴别细菌。
革兰染色法
该染色法是最常用最重要的染色法。是丹 麦细菌学家革兰于1884年创建的，至今仍 广泛应用。
红色－－革兰阴性菌
革兰染色意义
★有助于鉴别细菌 ★有助于选择用药 ★有助于了解细菌的致病性
影响革兰染色的因素
1. 操作因素 ★涂片的厚薄 ★脱色时间的长短
2. 染液因素 ★卢戈碘液放置时间过长 ★ 95％乙醇挥发 ★结晶紫与草酸铵混合时间太长
3. 细菌因素： ★细菌种类 ★细菌菌龄
细菌悬液
盖玻片 载玻片
悬滴法
镜检
（二）染色标本检查法
观察细菌的形态、大小和排列，还能鉴别细菌。
染色标本的检查法
细菌体积小、半透明，经染色后才能观 察清楚。
染色法是染色剂与细菌细胞质结合。最 常用的染色剂是盐类。
碱性染色剂是由有色的阳离子和无色的 阴离子组成；酸性染色剂则相反。细菌 细胞质富含核酸，可以与带正电荷的碱 性染色剂结合；酸性染料不能使菌体染 色，而使背景着色而形成反差，故称负 染。
革兰阳性菌等电点低（pI）为2~3，在中性或碱 性环境中所带负电荷多；革兰阳性菌pI为4~5，所带 负电荷少，影响结合染色的多少。
实验材料与方法
（一）材料: 菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌培养物 染液：结晶紫染液、卢戈碘液 95%酒清、稀释复红 其他：玻片、接种环、酒精灯 无菌生理盐水、显微镜等
（二）方法： 细菌涂片的制作：涂片、干燥、固定 革兰染色：初染、媒染、脱色、复染 油镜使用：观察染色结果并记录
染色方法：
结晶紫 1分钟 卢戈碘液 1分钟95％乙醇 30S～1min 稀释复红
初染 水洗 媒染 水洗 脱色
水洗
复染
影响革兰染色的关键步骤是脱色
水洗
干燥
Procedures of Gram Staining
初染
结晶紫1分钟
媒染
卢戈氏碘液1分钟
脱色
95%酒精30秒
复染
稀释复红30秒
革兰染色结果
紫色－－革兰阳性菌