古骨伤愈合剂对正常兔股骨头内ＶＥＧＦ基因的表达无影响。 【关键词】 恒古骨伤愈合剂；股骨头坏死；免疫组织化学；原位杂交，荧光；血管内皮生长因子
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甲基强的松龙粉针剂（ＭｅｔｈｙｌｐｒｅｄＩｌｉｓｏｌｏ眦，ＭＰｓ，ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＮＶ／ｓＡ，批号：ＬＫ０９８４）。生理盐水（昆明南疆制药有限公司， 批号：２００５０２０１）。 １．１．２动物健康成年新西兰大白兔１５０只，体质量２．５— ３．５ ｋｇ，雌雄不限，由昆明医学院实验动物中心提供，实验动
一仪器厂），０ｐｔｉ咖荧光定量ＰＣＲ仪（美国ⅢＲｅ吲Ｉｒｃｈ公司）。
１．１．４试剂ＶＥＧＦ（ＭＡＢ—２４３）ｓＰ免疫组织化学试剂盒（鼠 抗人，福州迈新公司）、二甲苯、梯度乙醇、ＰＢＳ（迈新编号：
ＰＢｓＪ００６０）、苏木精。ⅦＧＦ ｍＲＮＡ寡核苷酸探针杂交试剂盒 （武汉博士德公司，适用种属：人、大鼠、兔、小鼠组织）。％ｚｏｌ
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１．２．３给药经用人与兔体表面积用药量的换算，计算出每 只兔子所需恒古骨伤愈合剂的剂量。于造模第５周开始， Ｂ组和Ｄ组用恒古骨伤愈合剂按算出的剂量灌胃１次／２ ｄ。 Ａ组及Ｄ组用算出中药剂量的等量生理盐水灌胃，１次／２ ｄ。 造模及给药期间均未给文中所述之外的其他药物。 １．２．４取材于给药第４、８、１２周末，各组各取８只兔，用大 量空气栓塞法处死后取出双侧股骨头。一侧置于液氮罐中保 存作ＰＣＲ检测用，另一侧沿冠状面剖开，分别进行免疫组化 和原位杂交检测。 １．２．５免疫组化检测用石蜡切片免疫组织化学ＳＰ法，按 其规程操作。综合阳性着色深浅和阳性细胞数判定ＶＥＧＦ表 达强度。 １．２．６原位杂交检测按试剂盒说明书的规程操作。综合 阳性着色深浅和阳性细胞数判定ＶＥＧＦ表达强度。 １．２．７实时荧光定量ＰｃＲ检测
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·７５７·
·基础研究·
恒古骨伤愈合剂对激素性坏死股骨头内ＶＥＧＦ 基因表达的影响
赵宏斌１，胡敏２，王维琦３，李林芝１ （Ｌ昆明医学院第一附属医院骨科，云南昆明６５００３２；２．昆明市卫生学校；３．昆明医学院第三附属医院）
【摘要】 目的：研究中药恒古骨伤愈合剂对兔坏死股骨头内ＶＥＧＦ基因表达的影响。方法：成年新西兰大白兔 分为４组：Ａ组（空白对照组），Ｂ组（正常兔服用恒古骨伤愈合剂），ｃ组（造模后不喂恒古骨伤愈合剂），Ｄ组（造模后
ｉｎ刚ｐ ｙｌｐ帕“∞Ｌ啪ｅ（ＭＰＳ）（２０ ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｌｌｔ，ａｔ ａｔ妇ｉｎｔｅｒｖａｌ ０ｆ２４ ｈｏｕｒｓ）．０ｎｃｅ ｅｖｅｒｙ ２ ｄａｙ８，ｔｌｌｅ ｓｔｏＩｎａｃｈ
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物生产许可证号：ｓｃｘＫ（滇）２００５枷０８，实验动物使用许可证
号：刚ｘＫ（滇）２００５枷４。实验兔均在昆明医学院实验动物
中心饲养用药，饲养期间给兔颗粒饲料（由昆明医学院实验
动物中心提供），自由饮水，通风，单笼饲养，适应性喂养２周。 １．１．３仪器ＣＭ２０００ｃ型北航医学病理图像分析仪。高速离
心 （辆机ｄ（ｏＥｌｐｆｐＢｅｉｎ叩ｄ０ｈ１ｏｆ啪Ｃ坝ｅｎ盯ｔ，ｍｇ德ｅ 国５８）０，４－电Ｒ， 泳德 槽国 （Ｄ）Ｙ， Ｙ－Ⅲ紫型外，分北光京光市度六计
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态观察兔股骨头内、ｍＧＦ基因表达的变化特点。结果：喂药至第４、８周时，比较Ｄ组与ｃ组股骨头内ＶＥＧＦ基因表达 量的差别无统计学意义。喂药至第１２周时，Ｄ组与Ｃ组股骨头内ＶＥｃＦ基因表达量的差别具有统计学意义（Ｐ＝ Ｏ．０４２＜０．０５）。Ｂ组与Ａ组比较差别无统计学意义。结论：ＬＰＳ加ＭＰｓ制作的兔股骨头坏死模型中股骨头内ｖＥＧＦ 基因表达受抑制。中药恒古骨伤愈合剂可促进坏死股骨头内源性ＶＥＧＦ基因的表达，以用药时间长者效果明显。恒
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（Ｉｎ订叻ｇｅｎ，美国，批号：１５５９６旬１８），ＤＮａ∞Ｉ（ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ， ５∥ｐｌ，大连宝生生物工程有限公司），ＲＮａ靶Ｉｎｈｊｂｉｔｏｒ
（加∥ｍ，美国Ｐｒｏ眦ｇａ公司）。１０×Ｂ哦ｒ ＲＴ（德国Ｑｉａｇｅｎ
公司），ｄＮ７ｒＰ（５ ｍＭ，德国Ｑｉａｇｅｎ公司），Ｑｍｍｉ∞ｒｉｐｔ ＲＴ （４０∥山，德国Ｑｉａｇｅｎ公司），ＲＮａ∞一Ｆｒｅｅ眦ｔｅｒ（德国Ｑｉａｇｅｎ 公司）。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅ肿ｉｘ荧光定量染料（加拿大Ｂｉｏ—Ｒａｄ
喂恒古骨伤愈合荆），每组２４只。以大肠杆菌内毒素（吣）（１０彬ｋｇ体重）间隔２４ ｈ静注２次加甲基强的松龙
（ＭＰｓ）肌注３次制作兔股骨头坏死模型后，Ｂ组和Ｄ组用恒古骨伤愈合剂，Ａ组和Ｃ组用等量生理盐水，按计算出的
药量灌胃，１西沈ｄ。于喂药至第４、８、１２周时取股骨头行免疫组化、原位杂交并提取总ＲＮＡ行实时荧光定量ＰｃＲ，动
（１）从液氮中取股骨头，置于无菌的研钵研成粉末状后， 转入离心管，以％∞ｌ试剂加入该管后，按％ｚｏｌ法的操作规 程提取兔股骨头总ＲＮＡ。
（２）引物设计及合成：ＶＥＧＦ上游引物：５’．ＧＴＧＧＡ－ ＣＡＴＣｒＩＴＩ＇ＣＣＡＧＧＡＧＴＡＣＣ一３’。下游引物：５ ７－ＣＡＴＣＣＧｃＡＴ． ＧＡＴＣＴＧｃＡＴＧＧＴＧ－３’。Ｂ—ａｃｔｉｎ上游引物：５’－ＣＧｃＴ（沁ＡｃＴ－
１．１．１药物恒古骨伤愈合剂（由三七、黄芪、人参、红花、杜 仲、鳖甲、陈皮等配方制成，每毫升生药含量Ｏ．３６ ｇ），规格 ２５ ｎ∥瓶（云南克雷斯天然药物制药厂，批号：２００５０５１３）。大
肠杆菌内毒素（１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈ耐ｄｅｓ劬ｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｌｌｉａ ｃｏｌｉ ０１１ １：
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恒古骨伤愈合剂是源自云南的国药准字药物，主要由三 七、人参、红花、杜仲等配制成，股骨头坏死（ｆｅｍｏｒａｌ ｈｅａｄ ｎｅｃ－ 瞄ｉ８，ＦＨＮ）是其治疗适应证之一。为了探索中药恒古骨伤愈
万方数据
·７５８·
合剂治疗ＦＨＮ的作用机制，我们通过免疫组化、原位杂交和 实时荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ．ｔｉｍ Ｑ．ＰＣＲ）等技术，研究了恒古骨 伤愈合剂对ＦＨＮ修复过程中血管内皮生长因子（ｖ∞ｃｕｌ缸ｅｎ． ｄｏｔｈｅｌｉａｌ鲫眦ｈ ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）基因表达的影响。 ｌ材料和方法 １．１材料
ｇ唧ｗｉｔｌｌｏｕｔ ｓ．１Ｉ缸：ｒ１１ｌｅｒｅ ｗｅｒｅ呐ｓｉ印ｉｆｉｃ蚰ｔ ｄｉ瞻ｒｅｎｃｅ ｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ珊０ｆ ｔｌＩｅ ＶＥＧＦ ｇｅ舱ｂｅｔ’佗蛐珊）ｄｅｌ
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ＴＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧ．３’，下游引物：５’－ＣＡＧＧ从ＧＧＡＧＧＧＣ７ｒｏＧＡＡ－
ＣＡ－３’。
以上引物均由上海生工生物工程公司合成、纯化。 （３）实时荧光定量ＰＣＲ：加入２５０ ｎｇ／山的ｃＤＮＡ模板 ２山，１０一ｓＹＢＲ Ｇ陀ｅｎ Ｉ荧光染料，上下游引物各０．５一，双 蒸水７山，每个反应体系２０一，加入定量ＰｃＲ仪专用毛细管