多肽类药物制剂研究现状方宏清(军事医学科学院生物工程研究所　北京　100071)摘　要　多肽类药物制剂研究面临的主要问题是多肽的稳定性不好、体内半衰期短和生物膜透过性差。

本文综述了多肽类药物不稳定的原因;提高多肽稳定性的方法;多肽类药物制剂货架时间的确定;多肽类药物的分析手段;多肽类药物的控释研究;多肽的非注射途径给药研究。

最后还提出了多肽类药物制剂研究的展望。

关键词　多肽　药物制剂　稳定性　控制释放　非注射途径给药 随着生物技术的发展,多肽作为药物在临床上的应用越来越广泛,相应的制剂学研究也日益受到重视。

与传统的小分子有机药物相比,多肽具有稳定性差,体内半衰期短和不易通过生物膜等特点。

本文从稳定性、缓释系统、非注射途径给药三方面对多肽类药物制剂的研究概况进行介绍。

1　多肽的稳定性研究1.1　引起多肽不稳定的原因[1～3](1)脱酰胺反应　在脱酰胺反应中, Asn/Gln残基水解形成Asp/Glu。

非酶催化的脱酰胺反应与环境条件和多肽的结构有关。

提高pH值、升高温度都将有利于脱酰胺反应的进行。

在-Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解,位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。

(2)氧化　多肽溶液易氧化的主要原因有两种,一是溶液中有过氧化物的污染,二是多肽的自发氧化。

在所有的氨基酸残基中, Met、Cys和H is、Trp、Ty r等最易氧化。

氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。

(3)水解　多肽中的肽键易水解断裂。

由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂,尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽键。

(4)形成错误的二硫键　二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键,导致三级结构改变和活性丧失。

(5)消旋　除Gly外,所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的,易在碱催化下发生消旋反应。

其中Asp残基最易发生消旋反应。

(6)β-消除　β-消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。

Cys、Ser、Th r、Phe、Ty r等残基都可通过β-消除降解。

在碱性p H 下易发生β-消除,温度和金属离子对其也有影响。

(7)变性、吸附、聚集或沉淀　变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。

在变性状态,多肽往往更易发生化学反应,活性难以恢复。

在多肽变性过程中,首先形成中间体。

通常中间体的溶解度低,易于聚集,形成聚集体,进而形成肉眼可见的沉淀。

蛋白质的表面吸附是其贮存、使用过程中遇到的另一个令人头痛的问题,如r IL-2在进行灌注时会吸附在管道表面,造成活性损失[4]。

1.2　提高多肽稳定性的途径[1,3](1)定点突变　通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳16 药　学　进　展 1998年　22卷　第1期军事医学科学院青年科研基金资助项目定性的残基,可提高多肽的稳定性。

(2)化学修饰　多肽的化学修饰方法很多,研究最多的是PEG修饰。

PEG是一种水溶性高分子化合物,在体内可降解,无毒。

PEG与多肽结合后能提高热稳定性,抵抗蛋白酶的降解,降低抗原性,延长体内半衰期[5]。

选择合适的修饰方法和控制修饰程度可保持或提高原生物活性。

(3)添加剂　通过加入添加剂,如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类,可以提高多肽的稳定性[6]。

糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围,因而提高了多肽的稳定性。

在冻干过程中,上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象,而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。

此外表面活性剂如SDS、Tw een、Pluro-nic,能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。

(4)冻干　多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β-消除、水解等都需要水参与,水还可以作为其它反应剂的流动相。

另外,水含量降低可使多肽的变性温度升高[7]。

因此,冻干可提高多肽的稳定性。

1.3　多肽类药物制剂的存放时间测定对动力学行为符合Arrhenius公式的药剂,可利用加速实验确定存放时间,但要求反应活化能是独立于温度的常数。

通常认为基于Arrhenius公式的稳定性预测不适于多肽制剂,这是因为在进行蛋白质药物加速实验时有三个问题难以解决:(1)多肽的降解途径较多,各途径活化能不同,升高温度会改变多肽降解的主要方式;(2)温度会改变多肽的构象,从而改变降解反应的活化能;(3)对冻干制品,若实验温度高于玻璃化温度(Tg),固体制剂将由玻璃态变为粘塑性状态,化学反应速率将急剧增加,从高于Tg获得的数据就不能外推到低于Tg时的情况。

但是,如果能解决上述问题,利用加速实验进行稳定性预测就可以成为评价多肽药物制剂的有效工具。

Yo shio ka等人[8]通过加速实验确定了六种多肽制剂在25℃存放的有效时间,结果表明与实测结果基本接近。

这说明在一定条件下可用加速实验估算多肽制剂的货架时间,特别是在研究初期,用加速实验可节省大量时间和物力。

但是,最终货架时间的确定还是需要采用留样观察法。

1.4　多肽类药物制剂的分析手段多肽类药物制剂研究常用的分析手段有:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、凝胶过滤层析法、反相液相层析法、紫外光谱法、荧光光谱法、红外光谱法、圆二色性光谱法、量热法以及生物活性测定法[9]。

这里仅介绍药物制剂研究中常用的一种方法——量热法(Calorimetry)。

量热法是通过测定样品在受热过程中的放热和吸热行为来研究样品中各组份的相互作用及状态变化的一种方法,常用的是差示扫描量热法(Differentiat Sca nning Calo rim etry)。

该方法广泛用于多肽的热稳定性分析、各种添加剂对多肽结构的影响、多肽与配基之间的相互作用等研究,还用于测定冻干物品的玻璃化温度和共熔点。

例如, Chan等[10]用DSC研究了添加剂对rh DNase 溶液热变性的影响。

蛋白质浓度为10mg/ ml,扫描速率为1.2℃/min。

测得rh DNase 在纯水中的Tm=67.4℃,Hm=18.0J/g。

加入Ca2+有利于rh DNa se的热稳定,加入Mg2+、M n2+则不利于rhDNase的稳定。

当Ca Cl2浓度为20～100mmol/L时,Tm=76. 4℃,Hm=20～22J/g。

Ca Cl2和乳糖对rh D-Nase的稳定有复合作用。

同时加50mmol/L Ca Cl2和100mg/ml乳糖,可使rh DNase的Tm值提高到76.4℃,Hm值到21.9J/g。

Chang等[11]用DSC测定了rh IL-lra制剂的玻璃化温度、反玻璃化温度和共熔点。

冷冻蛋白制剂的各种物理变化,如玻璃化、反玻璃化和共熔都会影响冻干过程。

根据测定结果,作17多肽类药物制剂研究现状者确定了冻干温度和升温速度,仅用6个小时就完成冻干过程。

2　多肽类药物的缓释制剂研究多肽类药物在血液中的半衰期一般很短,静脉注射后很快就被清除或降解,因此需要经常给药,给病人带来较多不便。

为了减少给药次数可采用缓释或控释技术:(1)在注射液中加入高分子聚合物(如透明质酸),提高粘度、延缓药物扩散速度;(2)将多肽包裹在脂质体中,使多肽从脂质体中缓慢释放出来;(3)将多肽包裹在固体微粒中,使多肽从微粒中缓慢释放出来。

在上述方法中研究最多的是微粒递释系统。

适于制备微粒的生物可降解材料有:聚乳酸、丙交酯和乙交酯共聚物(PLC A)、聚己内酯、聚氨基酸、聚原酸酯、聚酐、聚腈基丙烯酸烷基酯[12]。

多肽的微囊大多采用聚酯材料,特别是用PLGA。

PLGA微粒释放蛋白质的典型曲线分三相:起始爆释相、扩散控释相和分解控释相。

起始爆释是指位于微粒表面或近表面的蛋白质在几小时内的快速释放。

扩散控释是蛋白质通过微粒中孔道扩散释放。

为了获得连续释放,扩散控释相必须与分解控释相重叠,聚合物分解形成的孔隙使包裹的蛋白质连续释放。

而主要的困难是降低起始爆释,增加药物载量。

已用该法制备了许多肽和多肽的微粒剂型,如LHRH、T RH、Insulin、GH、SOD、TN F、IFN、IL-2、EPO等。

其中LHRH类似物leuprolide的微粒制剂可控制释放药物长达一个月,并于1988年首先在法国上市,随后又在欧美40个国家上市,1993年起在我国销售。

美国Genetech公司的研究人员也成功地制备了连续释放一个月的rh GH和IFN-γ微囊制剂[13,14]。

3　非注射给药途径研究多肽类药物分子量大,脂溶性差,难以透过生物膜,一般只能注射给药。

但注射给药、尤其是那些需要频繁给药的药物,对病人来说是极其不便的。

因此有必要进行多肽的非注射给药途径研究。

文献报道的多肽非注射给药研究途径有:鼻腔、肺部、眼、舌下、口服、直肠、阴道、皮肤等,其中研究最多的是鼻腔给药、肺部给药和口服给药。

3.1　鼻腔给药鼻腔部位存在丰富的毛细血管和淋巴管,鼻腔上皮与血管壁紧密相连,上皮细胞间间隙较大,具有较高的渗透性,能避免肝脏的首过效应,鼻腔部位蛋白酶含量也比胃肠中少。

低分子量的药物极易被吸收进入血液循环。

对分子量较大的多肽,如降钙素、胰岛素、G-CSF、EPO等,在合适的吸收促进剂帮助下,也可被吸收,但生物利用度较低[15]。

鼻腔给药的方式有滴鼻给药法和喷雾给药法,采用后一方法可获得相对较高的生物利用度。

目前降钙素(32肽)已有鼻腔递释制剂在欧洲、日本及美国上市,尽管其绝对生物利用度不足1%。

1990年在美国上市的Nafa relin (十肽)鼻腔喷雾剂,其生物利用度也仅2. 8%。

3.2　肺部给药人肺的吸附表面积有140m2,血流量达5000m l/min,蛋白酶活性相对于胃肠道较低,不存在肝脏首过效应。

肺泡壁比毛细血管壁还要簿,通透性好。

动物实验表明一些多肽药物经肺给药后生物利用度相当高,可达20%～50%。

但某些多肽易被肺中蛋白酶降解,还有一些多肽在形成气溶胶微粒时会变性。

哪一种多肽适合于经肺给药需逐例分析研究。

选用合适的给药装置将药物输送至肺泡组织是肺部释药的关键。

粉雾剂将是肺部递释的主要剂型[16]。

理想的粉雾剂应是:粉末处方组分在低流速和低压力差时,大部分药物粒子能够解聚,进入粉雾气流中;吸入装置则易产生流速较高的湍流。

目前多肽的肺部18 药　学　进　展 1998年　22卷　第1期给药还处在研究阶段,除Pulm ozy me(作用于肺部)外[17],还没有一种多肽药物的肺部递释制剂上市。

3.3　口服给药口服给药是最受人们欢迎的给药途径,多肽类药物也不例外。

但是正常情况下,大多数肽类药物很少或不能经胃肠道吸收。

其原因主要有:(1)多肽分子量大,脂溶性差,难以通过生物膜屏障;(2)胃肠道中存在着大量肽水解酶和蛋白水解酶可降解多肽;(3)吸收后易被肝脏消除(首过效应);(4)存在化学和构象不稳定问题。