实验题目: 湖塘水体叶绿素a测定姓名：学号：班级：组别：第一组指导教师：1.实验概述1.1实验目的及要求(1)初步了解叶绿素a测定的原理和常规测定方法;(2)通过实验，掌握叶绿素。
的测定方法及富营养化水样的前处理方法;(3)熟练掌握抽滤装置及分光光度计的使用。
1.2实验原理浮游植物的主要光合色素是叶绿素((Chlorophyll)，常见的有叶绿素a、b和c。
叶绿素a (chl-a >存在于所有的浮游植物中，大约占有机物干重的1-2%，是估算浮游植物生物量的重要指标，因此浮游植物叶绿素a含量的测定成为浮游植物生物量的重要指标而被广泛应用。
浮游植物叶绿素a的测定方法有许多种，根据所使用的仪器可以分为高效液相色谱法<HPLC法)、荧光光度计法和分光光度计法等。
高效液相色谱法能够很精确地测定各种光合色素的含量，但由于仪器昂贵，分析操作步骤繁琐，一般不能用于野外大量样品的快速分析。
荧光光度计也能够精确地测定叶绿素a的含量，特别是能够测定叶绿素a含量较低的样品，但由于分析过程中容易受其他色素或色素衍生物的干扰，也不利于快速分析各类不同的野外样品。
因此，分光光度计法成为最常用的浮游植物叶绿素a含量的测定方法。
在所有分光光度计法中，根据所用的色素萃取液分为了丙酮法、甲醇法和乙醇等，再根据比色所用的，又分为单色法和多色法(例如单色丙酮法和四色丙酮法)等。
主要的细胞破碎法有研磨、低温冻融、超声破碎等。
尽管丙酮现在仍厂泛用于实际分析中，但由于丙酮的萃取效率比较差，特别是对蓝藻的叶绿素a的萃取效率比较低，使得甲醇和乙醇成为替代丙酮的色素萃取剂。
不过，甲醇对人体毒害性大，且在酸化过程中容易产生误差，于是，乙醇成为现在广泛应用的叶绿素a的萃取剂。
超声破碎法因快速、提取效率高等特点也被研究者所青睐。
本实验介绍一种以热乙醇为萃取溶剂，结合超声细胞破碎法为基础的叶绿素a含量侧定方法。
2.实验内容2.1实验方案设计每组选择一个池塘，实地取水样，测定水样的叶绿素a含量。
2.2实验条件2.2.1实验仪器:1) 幼分光光度计1台;2)抽滤装置(砂芯过滤器、负压表、真空泵等)1台;3)4000r/min离心机1台;4) 15mL带刻度及螺旋盖的离心分离试管6个;5)恒温水浴锅1台;6)直径47 mm的醋酸纤维滤膜;8)超声细胞破碎仪9 ) icm玻璃比色皿2个10)表面皿若干11)10mL比色管7个;2.2.2实验材料1）90%乙醇2）1mol/L盐酸2.3实验过程（实验步骤、记录、数据、分析）2.3.1实验步骤(1) 水样预处理：实验水样由实验室培养的铜绿微囊藻稀释而得，分别取三组浓度水样各50ml，每组两个平行样。
将水样通过醋酸纤维滤膜抽滤，抽滤时负压不应大于0.5大气压（50kPa）。
抽滤完毕后，用镊子小心的取下滤膜，将其对着(有浮游植物样品的一面向里）再用普通滤纸吸压，尽量去除滤膜上的水分;滤膜放置表面皿上冷冻12h以上。
（2）Chl-a的提取:将滤膜剪碎，放入具塞离心管，加入6 mL热乙醇(75℃恒温提取2 min 后用细胞破碎仪破碎，超声时间3S，间隔2S，破碎5 min后，用少量上清液清洗细胞破破碎仪探头（小于1ml）。
将装有提取液的离心管放入离心机，转速4000r/min下离心10min，将上清液移入10 mL比色管中，再用2 mL 热乙醇提取液清洗、离心二次取得上清液清洗、离心两次取得上清液。
最后将提取液定容到10 ml。
（3）Chl-a含量的侧定:用含90%的乙醇溶液座位空白对分光光度计调零。
分别记录在750 nm与665 nm处各自的吸光度(分别记为750a和665妒，750 nm 处的测定是用来进行浊度校正的，吸光度应很低。
665 nm处的吸光)如拉在0.1-0.8单位之间。
在比色皿内加入1滴1mol/l 盐酸使酸化，混匀1 min。
再记录750nm 和665 nm处的吸光度(记为750b和665b)2.3.2数据记录和处理两种波长下叶绿素吸光度测定原始数据：编号665a 665b 750a 750b1 0.090 0.081 0.026 0.031Ⅰ 2 0.090 0.081 0.026 0.0313 0.090 0.081 0.026 0.031平均值0.090 0.081 0.026 0.0311 0.259 0.195 0.033 0.040Ⅲ 2 0.259 0.194 0.033 0.0413 0.259 0.195 0.033 0.041平均值0.259 0.195 0.033 0.0411 0.248 0.190 0.030 0.036Ⅳ 2 0.248 0.190 0.030 0.0363 0.248 0.190 0.030 0.036平均值0.248 0.190 0.030 0.036 通过吸光度的差值来计算对浊度的校正：665a-750a=校正后的665a的吸光度665b-750b=校正后的665b的吸光度数据处理：一号样：校正后的665a的吸光度=665a-750a=0.090-0.026=0.064校正后的665b的吸光度=665b-750b=0.081-0.031=0.050三号样：校正后的665a的吸光度=665a-750a=0.259-0.033=0.226校正后的665b的吸光度=665b-750b=0.195-0.041=0.154四号样：校正后的665a的吸光度=665a-750a=0.248-0.030=0.218校正后的665b的吸光度=665b-750b=0.190-0.036=0.154用校正后的665a与665b的吸光度值进行如下计算：叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(V E×l) mg/m³式中：Ve———乙醇的准确体积ml;V E———水样的体积L;l———比色皿的长度cm.一号样：叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(V E×l) mg/m³=29.62×（0.064-0.050）×10÷(2×1) mg/m³=2.073mg/m³三号样：叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(V E×l) mg/m³=29.62×（0.226-0.154）×10÷(0.05×1) mg/m³=426.5mg/m³四号样：叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(V E×l) mg/m³=29.62×（0.218-0.154）×10÷（0.05×1）mg/m³=379.1mg/m³2.4结论从计算结果对比来看，采样点水样的叶绿素含量较低，取样点水面虽有部分绿色藻类，但是可能由于雨水或取水样时人为等因素的影响使其冲散，也可能是水体中适合生长的优势藻类本身含有较少的叶绿素a。
还有，2、3组为平行实验，但结果却有出入，其原因可能是由操作过程引起的，如萃取过程、定容过程、超声破碎完冲洗过程、转移过程和测量吸光度的过程等均有可能带来误差。
2.5思考题。
1、查阅资料，根据所得的叶绿素a的含量，判断所测水样的富营养化程度，并说明依据。
查阅相关资料得：表一富营养化评价标准从上面有关资料可以看出，1号为贫中营养，3、4号为重富营养。
2.试对乙醇-超声法的优缺点加以分析。
优点：有较高的精密度，操作简便快捷，重复效率高，减少了叶绿素a在提取分析过程中的损失，萃取效率高，误差小，而且乙醇对人体的健康影响小，较安全。
缺点：1、水浴温度、萃取时间把握的不够准确，过高或过低的温度、萃取时间的长短都会影响释放的叶绿素的含量进而影响测定结果。
2、乙醇具有易挥发的特点，在实验过程中其浓度会降低而影响实验结果。
3、向比色皿中加酸后让其静置一分钟时没有完全混匀，影响其吸光度的测定进而影响实验结果。
3.本实验还有哪些地方需要改进，请给出你的建议。
（1）应该对池塘多取几个代表性的监测点进行测定，以便为后面对池塘富营养化研究提供更为全面的数据；（2）叶绿素4.为什么要用665nm和750nm这两个波长来测量进行计算？因为665nm波长处的吸光度较大，在0.1-0.8单位之间，可以减小误差；而750nm处波长的吸光度比较低，是用来消除悬浮物的干扰，进行浊度校正的。
5．为什么要加入盐酸进行酸化？答：存天然水体中，浮游植物中不仅存在着具有光合活性的叶绿素a，而且存在着没有光合活性的脱镁叶绿素a，因此应用叶绿素a作为浮游植物生产量的主要指标时需将叶绿素a与脱镁叶绿素a区分开来。
叶绿素a经酸化处理后，镁原子被氢原子取代，叶绿素a降解为脱镁叶绿素a。
脱镁叶绿素a与等量的叶绿a相比，存6 6 5 nm波长下,具有较低的消光系数,故要用酸化的方法测定叶绿素前后光密度的变化。
6.计算叶绿素a的公式的来因。
答：因为在测定过程中，根据测定原理，凡参与计算的各光密度值都应减750nm 处的光密度值，以消除悬浮物质的干扰。
首先测定酸化前和酸化后的光密度E665b和E665a(酸化前测定的光密度值用D665b、D750b表示，酸化后测定的光密度值用D665a、D750a表示)。
E665b=D665b—D750b E665a =D665a—D750a 根据Lorenzen公式。
计算单位样品中叶绿素a含量，采用热乙醇为萃取溶剂，A = 11.5，K=2.43,比色皿光程为1cm，带入最后可得公式叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(VE×l) mg/m³。
2.6 参考文献【1】陈宇炜、高锡云，浮游植物叶素a含量测定方法的比较测定【J】．湖泊科学，2000，12(2)：185-188．【2】杨彩根、宋学宏、孙丙耀，浮游植物叶绿素a含量简易测定方法的比较【3】梁兴飞、郭宗楼，超声辅助热乙醇提取法测定浮游植物叶绿素a的方法优化【J】,水生生物学报（2006）856-861【4】杨洪芳，丁峰元，陈德辉，乙醇-超声法在浮游植物叶绿素a含量测定中的应用【J】，海洋渔业（2006）309-313指导教师评语及成绩：成绩：指导教师签名批阅日期。