质粒载体
质粒（plasmid）是能自我复制的双链环状DNA分 子，它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在。 每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，它 能帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。 高拷贝数的质粒，在宿主细胞中能达10～100个拷 贝；低拷贝数的质粒，在宿主细胞中只有1－4个 拷贝。 质粒要成为克隆载体，就必须进行遗传改造，使 之成为一个具有单一的限制性内切酶识别位点、 多个选择性标记。
转基因的方法和原理
目的基因制备和载体系统 几种有效的转基因方法 转基因生物的筛选与鉴定
基本步骤
1.分离获得目的基因； 2.在体外进行DNA重组，将外源DNA连接到
能自我复制又带有选择标记的载体上； 3.将重组DNA转移入受体细胞； 4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆；
pUC19质粒


长2686bp，带有pBR322的复制 起始位点，一个氨苄青霉素抗性 基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子 β－半乳糖苷酶基因（lac Z’）的 调节片段，一个调节lac Z’基因 表达的阻碍蛋白的基因lac I，还 有多个单克隆位点。 pUC19的筛选将转化细胞涂布到 含有氨苄青霉素、IPTG和X－ gal的固体培养基上，那些带有 自身环化质粒的细胞由于能够形 成具活性的β－半乳糖苷酶，所 以菌落是蓝色，如果插入有目的 DNA片段，无法形成杂合β－半 乳糖苷酶，菌落时白色的。
Ti Plasmid
T-DNA region
已知农杆菌附着到 植物细胞后，只留
auxin
Left border Right border
在细胞间隙中。TDNA首先在细菌中被
加工、剪切、复制，
然后转入植物细胞。
vir genes
ori
农杆菌 与植物 细胞相 互作用 的机制
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基因枪转化法由美国
1）显微注射法 （microinjection）
2）逆转录病毒介导法
3）胚胎干细胞法
4）精子载体法
意大利Lavitrano等1989年首次报道利用精子作为载 体获得了转基因小鼠。
5）细胞核移植法
277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代 孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。
例 Gus检测
原理：β－Ｄ－葡萄糖酸苷酶基因（Gus），催 化β－葡萄糖苷酯类物质水解。其中很多水解 产物具有发色团或形成荧光物质。 例：组织化学法测定Gus活性 作用底物为X-gluc,产物是一种不可溶的5,5二溴，4,4-二氯靛蓝；
报告基因:
GFP（绿色荧光蛋白基因）; LUC (萤火虫荧光素酶基因);
3、转基因苗的筛选与鉴定
培养过程中利用标记基因筛选
选择标记基因(Slective gene)
抗生素类选择基因 抗除草剂类选择基因 生物安全性标记类选择基因 ……
标记基因
报告基因(Report gene)
β-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus) 荧光素酶基因(Luc) 氯霉素乙酰转移酶基因(Cat) 绿色荧光蛋白基因(Gfp) ……

质粒载体pBR322



1.大小为4361bp，含有抗氨 苄青霉素和抗四环素这样两 个抗生素抗性基因 2.在四环素抗性基因内部， 还具有BamH I、Hind Ⅲ和 Sal I 三个识别位点。 3.Pst I识别位点在氨苄青霉 素抗性基因 4.pBR322带有一个复制起 点，可以保证质粒只在大肠 杆菌里进行复制功能。

Tumor induced by A. tumefaciens
根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens),
是一种革兰氏阴性土壤杆菌,
它含有Ti质粒,能诱导被侵 染的植物细胞形成肿瘤, 即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包 括Ri质粒)上有一段转移 DNA,在农杆菌侵染宿主 植物时,这段DNA可以转 移进植物细胞,并稳定地 保留在植物细胞染色体中, 变为植物细胞新增加的一 群基因,最终能通过有性 世代遗传给子代 。
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PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇
(PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高 pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分 子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连, 并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间 的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进 入原生质体.
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动物外源基因的 导入方法

λ噬菌体载体



分类：插入型载体和置换型 载体。 插入型载体：具有单一的酶 切位点，可供外源DNA的 插入。 置换型载体：有成对的酶切 位点，在两个酶切位点之间 的DNA片段，可被外源 DNA片段置换。 λ噬菌体载体可以克隆较大 DNA片段，最大长度约为 24kb，只需将λ噬菌体DNA、 尾巴和纯化的空的头，混在 一起就可以在体外产生具有 侵染性的噬菌体颗粒。


目的基因 ③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 ④差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 ……


2.良好载体需要满足的条件
1、必须有自身的复制子； 2、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位 点，即多克隆位点，以供外源DNA的插入； 3、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性 重组子和阴性重组子； 4、载体分子必须有足够的容量； 5、可通过特定的方法导入细胞； 6、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启 动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调控元 件。
6）生殖细胞转染法
基因转移的方法
1.细胞融合 2.微细胞介导的基因转移 3.染色体介导的基因转移 4.脂质体介导的基因转移 5.磷酸钙沉淀物介导的基因转移 6.显微注射DNA 7.电脉冲介导的基因转移 8.激光，超声波介导的基因转移 9.重组RNA病毒感染 10.重组DNA病毒感染 <10－6 ≤10－6 <10－6 ≈2×10－4 10－3－10－7 ≈1－10％ 10～30％ 10～50％ ≈10～100％ ≈100％
表达荧光的转基因鱼
转基因植物的PCR检测
外源基因整合的PCR-Southern杂交检测 外源基因拷贝的IPCR检测 外源基因表达的RT-PCR
杂交鉴定
外源基因整合的Southern 杂交鉴定 外源基因转录的Northern杂交检测 外源基因表达蛋白的检测 外源基因整合及表达的原位杂交检测
Thank you !
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电击法的主要原理是
将原生质体在溶液中与 DNA混合,然后利用高压 电脉冲作用,使原生质体 膜的某些部位被击穿而 产生可回复的小孔,外源 DNA可通过小孔进入原 生质体内,而且不影响经 电击处理的原生质体再 生植物的能力.
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花粉管通道法是利用开
花植物授粉后形成的花粉 管通道,直接将外源目的基 因导入尚不具备正常细胞 壁的卵、合子或早期胚胎 细胞,实现目的基因转化.

2、遗传转化的方法
1、应用于植物转基因技术的方法
2、应用于动物转基因技术的方法
植物遗传转化的方法
（1）间接转化法——农杆菌介导转化法
（2）直接转化法
A、 基因枪转化法 B、 电击法 C、花粉管通道法 D、 PEG介导基因转化法
农杆菌: used extensively for genetic engineering of plants. 包含Ti质粒 Tumor inducing plasmid (bacterial plasmid) T-DNA (TransferredDNA), 可以转移进入植 物基因组.
Cornell大学的Sanfor (1987) 提出,它的主要原理是将包含 目的基因的载体包被在微小 的金属微粒(钨粒或金粒)表 面,通过高压驱动力加速微粒 穿透植物细胞壁,导入受体组 织细胞内,然后通过组织培养 再生出完整的植株.微粒上的 外源DNA进入细胞后,整合到 染色体上并得到表达,从而实 现基因的转化.。
柯氏质粒 Cosmid
柯氏质粒可克隆携带40kb大 小的DNA片段，并在大肠杆 菌中复制保存，综合了质粒 载体和噬菌体载体二者的优 点。 柯氏质粒上带有多个单克隆 位（RE2），两个cos位点， DNA复制起始位点和抗生素 抗性基因，在两个cos位点 之间还有一个限制性内切酶 位点（RE1）。
金大米
2012-10-23
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地雷探测草
拟南芥
2012-10-23
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不会引起过敏的大豆
2012-10-23
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转基因芥菜可减轻土壤污染
2012-10-23
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转基因西红柿
2012-10-23
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抗虫害作物
2012-10-23
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2012-10-23
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番木瓜优良抗病品种
2012-10-23
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转基因猪
2012-10-23
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2012-10-23
转基因熊猫狗
转基因技术
王海玲 2012.10.24
简介


转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的 是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现 某种性状。 转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。 转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分 子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目 的，实现对生物体的改造。