8
1.流速的转换
不改变线速度，流速与柱内径的平方成比例，速从 4.6 x 150 mm （5µm）到 2.1 x 50 mm(1.7 µm )，几何缩放流速的计算：
上述为方法转换时推荐流速，实际使用时可根据系统压力、保留时间以 及常用流速范围（如1.7 µm，2.1 mm内径色谱柱的常用流速范围为： 0.3～0.7ml/min ）进行调整。
24
应用实例1-阿托伐他汀有关物质检查
图1、阿托伐他汀钙有关物质HPLC图(进样20µL) 50分钟
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
图2、阿托伐他汀钙有关物质UPLC图(进样2µL)
17分钟
25
表1、阿托伐他汀钙有关物质HPLC梯度洗脱程序
时间（min） 0 25 35 40
40.01 50
流动相A（%） 48 48 10 0 48 48
75ml/针 75ml*18针 (1350ml)
6.8ml/针 6.8ml*18针
(122ml)
形成废液
＞3240ml
＞1350ml
＞122ml
消耗能源
7倍
3倍
1
假设：1000个样品一个月内必须完成。如果使用5μm，4.6X150mm色谱柱， 流速1.4ml/min，45min运行时间的方法，需要3套LC系统，14天来完成这个 实验。但是如果使用1.7μm，2.1X100mm色谱柱，流速0.4ml/min，11min运 行时间的方法，则只需要1台LC系统，10天就能完成。
灵敏度 ↑ 3X
(Increased optimal flow
(Peak height increases as peak width
rate & shorter column)
and column length decreases)
20
1、等度洗脱方法转换后的验证工作
1.1根据两种方法比对结果，鉴别和定量试验中峰顺序峰个数均一致， 且SST符合要求。方法中SST规定全面，包含了分离度、灵敏度。此时 经过比对，实验条件完全满足，可无需进行其他确认工作。
28
不同方法效率差别很大
有关物质和 含量测定
分析时间
欧洲药典 HPLC方法
120分钟/针 120*18针 （36小时）
修订后 HPLC方法
50分钟/针 50*18针 (15小时)
超高效 液相色谱方法
17分钟/针 17*18针 (5.1小时)
消耗流动相
180ml/针 180ml*18针 (3240ml)
由Van Deemter方程可以诠释小颗粒填料的分离优势，颗粒度越 小柱效越高，分离越好；此外，一方面由于粒径小，色谱柱内径 减小（4.6mm减小至2.1mm），载样量少，因此必须减少进样体积， 可能会影响灵敏度；另一方面色谱柱内径变小使得峰扩散减小， 峰宽变窄，峰高增高（柱效增大），信噪比增大，灵敏度增大。
22
2. 梯度洗脱方法转换后的验证工作
2.1根据两种方法比对结果，峰顺序峰个数均一致，有关物质及含量结果均 一致，且SST符合要求，SST要求全面，例如有R、灵敏度的规定，此时： （1）鉴别、含量、溶出度和含量均匀度：峰纯度/分离度满意即可； （2）有关物质：2～3种条件强制破坏试验，分别进样，比较两者图谱，检 测出杂质的情况应基本一致，且物料平衡结果基本一致即可。
液相色谱与超高效液相色谱方法如 何转换及验证
高青 2015.12.15
1
主要内容
一、背景与前提 二、方法如何转换 三、转换后的方法如何评估与验证 四、应用案例介绍 五、讨论
2
背景与前提
液相色谱是药物分析领域使用最广泛的技术手段，随着 小粒径色谱柱的发展，越来越多的业内人士期望使用亚 2μm粒径色谱柱的超高效液相色谱来拓宽选择性、提高工 作效率、降低耗能、减少污染。
1.2 根据两种方法比对结果，鉴别和定量试验中峰顺序峰个数均一致， 且SST符合要 求，有关物质及含量结果均一致，但方法中SST无灵敏 度规定，如下操作： （1）鉴别：可直接进行，无需验证； （2）有关物质：可取对照品溶液稀释，测定灵敏度，达到对照品溶 液二十分之一或更灵敏即可； （3）含量测定、溶出度、均匀度等：可直接转换。
9
2.进样体积的转换
用完全相同的样品
– 同样的浓度 – 同样的稀释倍数
计算对应于柱体积的进样体积，几何缩小
10 µL 进样量从 4.6 x 150 mm到 2.1 x 50 mm 4.6 x 150 mm
2.1 x 50 mm
10
2.进样体积的转换
供试品浓度不变 10 µL 进样量从 4.6 x 150 mm（5µm）到 2.1 x 50 mm(1.7 µm )
如果没有同品牌的小粒径填料色谱柱，可以参考一些比较成熟的色 谱柱分类手段，选择相似色谱柱。相关查询网址如下：
( /resources/freeware/colsel/) (/app/USPNF/columnsDB.html)
13
方法转换后的验证
准确性试验：考察辅料对主药的影响、溶剂提取、供试品制备的方 法；
线性范围：方法转换中，通过前述公式计算调整进样体积，使得方 法转换前后，供试品溶液进入色谱柱后，在柱内的浓度是一致的， 因此线性不变或变化十分微小；
重复性试验：考察供试品制备方法（例如是否能提取完全）； 稳定性试验：考察供试品溶液状态放置是否稳定； 专属性：筛选色谱柱、流动相、柱温以及流速的主要指标，方法开
如果柱效N相同, 峰高与柱长L成反比 :
Height
1 L
柱效相同, 柱长L 降低与颗粒度dp成正比 (固定 L/dp)
1. e.g., 5 μm，150mm 色谱柱同 1.7 μm，50 mm色谱柱柱效相当，分离度相当， 那么1.7um色谱柱的峰高应该是5um色谱柱的3倍 2. 同样的进样浓度，峰面积相同，因小颗粒色谱柱扩散小，峰展宽变小，峰宽变小，峰高变高
高 液相色谱
超高效液相色谱
超高效液相色谱
液相色谱
低
低
产品生命周期
5
背景与前提
《中国药典》2015年版HPLC通则（0512）关于色 谱柱粒径改变的使用规定：
若需使用小粒径（约2μm）填充剂，输液泵的性能、进 样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如 有必要，色谱条件也应作相应调整。当测定结果产生争议 时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。
10
表4、槐角苷测定UPLC梯度洗脱程序
时间（分钟） 0~0.2 0.2~3 3~18
18~18.1 18.1~20 20~20.1
25
流动相A（%） 10
10~15 15~20 20~90
90 90~10
10
流速（ml·min-1） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
流速（ml·min-1） 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
3
背景与前提
分离效果提高
<2 µm 3.5，2.5 µm 5 µm
<2 µm
更多样材质
10 µm
30-80 µm
2004年第一台超高 效液相色谱仪器问世
传统液相色谱仪器
1970s
1980s 1990s 2000s 分析时间缩短
2010s
高效率 低耗能 环保
4
效率提高、降低能耗和减少污染
高
工作效率飞跃式提升
需验证：分离度和灵敏度两个方面
15
van Deemter 方程
其他条件不变的情况下，扩撒越小，A、B项越小，H越小 H越小，N柱效越高
A项 + B项 + C项
H a(dp) b c(dp)2 µ
µ
A 项 涡流扩散/粒子间通道. 取决于颗粒大小和流速.
B 项 分子的轴向扩散. 反比于流速.
H a(dp) b c(dp)2 µ µ
图3、槐角苷测定HPLC图谱（进样10µL）
100分钟
图4、槐角苷测定UPLC图谱（进样1µL）
25分钟
27
表3、槐角苷测定HPLC梯度洗脱程序
时间（min） 0~5 5~18
18~84 84~85 85~89 89~90
100
流动相A（%） 10
10~15 15~20 20~90
90 90~10
发阶段已经进行了全面研究；此处方法转换，选择与原标准填料一 致或相似的色谱柱，流动相与原标准保持一致，柱温不变，流速根 据上述公式进行调整，使得线流速不变，专属性不受影响。
因此上述所及验证工作均无需重做。
14
方法转换后的验证
依然针对两者的差异进行验证：色谱柱填料粒径不同、系 统体积不同、仪器输送流动相系统内径不同，方法转换调 整了流速、进样量、梯度洗脱程序
C 项 传质动力学. 正比于流速和颗粒度的平方.
16
什么是 HETP?
H = HETP (理论塔板高度) {要求 H 尽可能小,这样就可以往柱子里‘装’更多的‘板’}
N ，柱效
N L HETP
N= # Plates (来自蒸馏理论)
Plate HETP
L 柱长
5 块板
(较大的 H) “较厚”
10块板
同时，由于不同仪器之间系统体积存在差异，也需要在转换时加以考虑。 梯度程序转换的计算过程这里不做详细描述。通常色谱仪器均配备转换软 件，输入原始洗脱程序，软件可自动计算并转换为目标仪器的洗脱程序， 然后根据色谱峰分离情况进行人工微调。
12
方法转换成功其他因素
为方便转换，并保持转换前后色谱行为一致，最好采用同品牌、相 同填料仅粒径不同的色谱柱。
为进样准确、重现性好，建议在UPLC上的最小进样体积为0.5 µL。 可根据灵敏度调整进样体积，最大进样体积为10µL，但为了减少溶剂扩散对分 离度的影响，推荐最大进样量不超过5 µL