第一章1、生物技术与微电子技术,新材料、新能源并列,是四大科学技术支柱,生物技术是以生命科学为基础,利用生物体的特性和功能,设计构建具有预期性状的新物种或新品系,并与工程相结合,利用这样的新物种,进行加工生产,为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。
2、生物技术可以分为传统生物技术、近代生物技术、现代生物技术。
3、近代生物技术的特点:(1)产品类型多(2)生产技术要求高(3)生产设备规模大(4)技术发展速度快4、现代生物药物四大类型:(1)应用重组DNA技术(2)基因药物(3)来自动、植物和微生物的天然生物药物(4)合成与部分合成的生物药物5、根据生物药物的功能途径可分为:(1)治疗药物(2)预防药物(3)诊断药物6、生物技术药物的特性(1)分子结构复杂(2)具有种属特异性(3)治疗针对性强、疗效高(4)稳定性差(5)基因稳定性(6)免疫原性(7)体内半衰期短(8)受体效应(9)多效性和网络性效应(10)检验的特殊性7、生物技术制药的特征:(1)高技术(2)高投入(3)长周期(4)高风险(5)高收益第二章1.基因工程药物分类:(1)免疫性蛋白(2)细胞因子(3)激素(4)酶类2.基因工程生产药物的优点在于:(1)可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽,为临床使用建立有效的保障。
(2)可提供足够数量的生理活性物质,以便对其生理、生化和结构进行深入研究,从而扩大这些物质的应用范围。
(3)可以发掘更多的内源性生理活性物质。
(4)内源性生理活性物质在作为药物使用时,存在不足,可通过基因工程和蛋白质工程对其进行改造。
(5)可获得新型化合物,扩大药物筛选来源。
3.基因工程药物制造的主要步骤:目的基因的克隆,构建DNA重组体,构建工程菌,目的基因的表达,外源基因表达产物的分离纯化,产品的检验。
4.制备基因工程药物的基本过程:获得目的基因—构建重组质粒—构建基因工程菌—培养工程菌—产物分离纯化—除菌过滤—半成品检定—成品检定—包装5.目的基因的获得:(一)反转录法:(1)mRNA的纯化(2)cDNA第一链的合成(3)cDNA第二链的合成(4)cDNA克隆(5)将重组体导入宿主细胞(6)cDNA文库的坚定(7)目的cDNA克隆的和鉴定(二)反转录—聚合酶链反应法(三)化学合成法(四)筛选基因的新方法(五)对已发现基因的改造6.基因表达:是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
7.基因高效表达:是指外源基因在某种细胞中的表达活性,即剪切下一个外源基因片段,拼接到另一个基因表达体系中,使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。
8.宿主菌应满足以下要求:具有高浓度、高产量、高产率;能利用易得廉价原料;不致病、不产生内毒素;发热量低,需氧低,适当的发酵温度和细胞形态;容易进行代谢调控;容易进行重组DNA技术;产物容易提取纯化。
9.影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素:(1)外源基因的剂量(2)外源基因的表达效率(3)表达产物的稳定性(4)细胞的代谢负荷(5)工程菌的培养条件9、影响目的基因在酵母菌中表达的因素:外源基因的剂量、外源基因的表达效率、外源蛋白的糖基化、宿主菌体的影响。
9.控制菌体生长对提高质粒的稳定性,减少代谢副产物的积累,提高外援蛋白产率都有重要意义。
10.基因工程菌生长代谢的特点:(一)菌体生长于能量的关系:各种碳源通过有限的呼吸能力所能提供的最大量决定了菌体在这种培养基中的最大生长速率。
(二)菌体生长和前体供应的关系:对于基因工程菌来说,由于质粒的复制和外源基因的转录和译翻需要与住宿菌竞争共同的前体和催化结构,从而加剧了这些成分的不足。
11.质粒不稳定性分为分裂不稳定和结构不稳定。
分裂不稳定:指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。
结构不稳定:是DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
12.提高质粒稳定性的方法:(1)选择合适的宿主菌(2)选择合适的载体(3)选择压力(4)分阶段控制培养(5)控制培养条件(6)固定化12、基因工程菌中试:中间性试验,是产品投产的关键,科技成果向生产力转化的必要环节,产品正式投产前的实验,大规模量产前的较小规模实验。
12、工艺最佳化:指最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳化速度与最低失败率等的综合指标。
13.影响基因工程菌发酵的因素有哪些?(1)培养基的影响:常用的碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。
(2)接种量的影响:适于表达外源蛋白产物的接种量是10%~15%(3)温度的影响(4)溶解氧的影响:外源基因的高水平转录和翻译,细胞需要大量的能量,以促进细胞的呼吸作用,提高了对氧的需求,因此只有维持较高水平的DO2(≥40%)才能提高带有重组质粒的细胞的生长,有利于外源蛋白产物的形成。
(5)诱导时机的影响(6)诱导表达程序的影响(7)PH的影响14.高密度发酵的定义:指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上,理论上的最高值可达200gDCW/L,是大规模植被重组蛋白质过程中不可缺少的步骤,实现在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下,通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。
15.影响高密度发酵的因素:(1)培养基(2)溶氧浓度(3)PH(4)温度(5)代谢副产物16.实现高密度发酵的方法:(一)发酵条件的改进:1、培养基的选择2、建立流加式培养方式3、提高供氧能力(二)构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌:1、阻断乙酸产生的主要途径2、对碳代谢流进行分流3、限制进入糖酵解途径的碳代谢流。
4、引入血红蛋白基因(三)构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌16、建立分离纯化工艺需了解的各种因素:含目的产物的初始物料的特点、物料中杂质种类和性质、目的产物特性、产品质量要求16、基因工程药物分离纯化的基本过程:细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品、成品加工。
17.重组蛋白质分离纯化常用的色谱分离方法有哪些?(1)离子交换层析(2)疏水层析(3)亲和层析(4)凝胶过滤层析1.离子交换层析适用于:多肽、蛋白质、核酸。
2.疏水层析适用于:蛋白质3.亲和层析适用于:蛋白质、酶等生物大分子。
基本原理:生物体中许多大分子生物化合物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性,如抗原与抗体、酶与底物或抑制剂、激素与受体等,这种结合往往是专一性的而且是可逆的。
4.凝胶过滤层析适用于:蛋白质、核酸、多糖18.蛋白质药物鉴定时常做那些分析?(目标产品的质量控制)(1)生物活性测定(2)理化性质鉴定:1.非特异性鉴别2.特异性鉴别3.相对分子质量测定4.等电点测定5.肽图分析6.氨基酸组成分析7.部分氨基酸序列分析8.蛋白质二硫键分析(3)蛋白质含量测定(4)蛋白质纯度分析(5)杂质检测(6)稳定性考察(7)产品一致性的保证第三章1、细胞工程:是以细胞为单位,按人们的意志,应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术,有目的地进行精心设计,精心操作,使细胞的遗传特性发生改变,从而达到改良或上升新品种的目的,以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力,从而在离体条件在进行大量培养、增殖,并提取对人类有用的产品。
2、动物细胞的生理特点:①细胞的分裂周期长:动物细胞分裂所需的时间一般为12~48h。
②细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制的现象。
③正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。
④动物细胞对周围环境十分敏感。
⑤动物细胞对培养基的要求高。
它不仅需要12种必需的氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素。
⑥动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌的不同。
3、细胞在体外培养成功所必须保证的基本条件是:(1)所用的与细胞接触的设备、器材和溶液,都必须保持绝对无菌,避免细胞外微生物的污染。
(2)都必须有足够的营养供应,绝对不可有有害的物质,避免即使是极微量的有害离子的渗入。
(3)保证有适量的氧气供应。
(4)需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物。
(5)有良好的适于生存的外界环境,包括ph、渗透压和离子浓度。
(6)及时分种,保持合适的细胞密度。
4、动物细胞的培养条件:①器材的清洗和消毒②水质③ph ④渗透压⑤温度⑥空气5、培养基中血清的作用:优点:(1)营养作用,因为它能提供培养基中的生长因子(2)解毒(3)中和胰酶的活性(4)提供促接触和伸展因子,使细胞贴壁,免受机械损伤(5)提供酶、微量元素和激素。
缺点:(1)批量之间有差异(2)价格昂贵(3)有各种污染。
6、动物细胞大规模培养的方法(一)悬浮培养:优点:操作简单,培养条件比较均一,传质和传氧较好。
缺点:细胞密度一般较低。
(二)贴壁培养:优点:适用的细胞种类广缺点:操作比较麻烦,培养条件不易均一,传质和传氧较差。
7、旋转细胞培养的特点:(1)可以模拟太空中微重力环境,细胞克服重力影响,易于聚集,能获得比普通重力环境中更高的细胞密度,培养液的密度率提高(2)细胞易于贴附在微载体表面,有利于细胞与细胞之间,细胞与基质之间的组合自学特性相互接触(3)有利于增值分化,直接影响基因的表达,获得间接刺激细胞的间分泌和旁分泌(4)固体、液体同时移动,层流减少,剪切力减少,易于维持细胞的3D结构(5)内部环境均匀,物质传递能力强,细胞质均匀分布(6)有利于建立体外癌细胞转移模型8、理想动物细胞生物反应器具备的条件:(1)制造生物反应器所采用的一切材料,尤其是与培养基、细胞直接接触的材料,对细胞必须是无毒性的(2)生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能(3)密封性能良好,可避免一切外来的不需要的微生物的污染(4)对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制,控制的精确度高,而且能保持环境质量的均一(5)可长期连续运转,这对于培养动物细胞的生物反应器显得尤其重要(6)容器加工制造时要求内面光滑,无死角,以减少细胞或微生物的沉积(7)拆装、连接和清洁方便,能耐高压蒸汽消毒,便于操作维修(8)设备成本尽可能低9、动物细胞生物反应器的类型:搅拌罐式生物反应器、气升式生物反应器、中空纤维式生物反应器、透析袋或膜式生物反应器、固定床或流化床式生物反应器。
10、动物细胞制药的前景与展望(1)改进表达载体,提高表达水平和产量(2)利用代谢工程,改进培养工艺,降低生产成本。
(3)抑制细胞凋亡,延长培养时期。
(4)采用糖基化工程,提高产品质量(5)转基因动物的研究(6)组织工程的研究。
第四章1、抗体(Ig):能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。
2、抗体的产生机理:免疫系统受抗原刺激,B淋巴消化增值分化为浆细胞,有浆细胞产生抗体。
3、单克隆抗体:针对一个抗原决定簇的抗体,又是单一的B淋巴细胞克隆产生的。