接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
限制性内切酶是一种能识别 DNA 上特定碱基组成的序 列并在这些序列位点上切断DNA分子水解磷酸二酯键的一 种内切核酸酶。
一、限制性内切酶的发现
附在E Coli上的噬菌体
（一）限制-修饰现象（restriction and modification）
Hind Ⅲ 代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzae) d 株中分离到的第3个限制酶。
四、限制性核酸内切酶学特性
一般分子量为60kd，单链多肽，最适 pH 为 6～8； NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基具有保护作
用； 对热不稳定，通常贮存于–20℃环境。为避免反复
Ⅱ，Ⅲ等。
名
属种 株序
称
名 名名 号
EcoRⅠ E co R Ⅰ
Hind Ⅲ H in d Ⅲ
HindⅡ H in d Ⅱ
HpaⅠ H pa / Ⅰ
菌株来源
Escherichia coli R Haemophilus influenzae d Haemophilus influenzae d Haemophilus parainfluenzaea
（二）寄主的限制与修饰
限制－修饰 ： 细菌能将外来DNA片段在 某些专一位点上切断，从而保证其不为外 来噬菌体所感染，而其自身的染色体 DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以 保护，这种现象叫做限制－修饰
（三）限制-修饰系统的作用（特点）
菌株内具有与内切酶活性相当的DNA甲 基化酶；
甲基化酶能把甲基加到与限制性内切酶 结合位点相同序列的A或C的亚基上;
基因工程工具酶
DNA 的基本结构
Structure and features
• 每一单链具有 5’-3’极性
• 两条单链间以氢键连接 • 两条单链，极性相反，反向平行 • 以中心为轴，向右盘旋
工具酶
工具酶是指能用于DNA和RNA分子 的切割、连接、聚合、反转录等有关的 各种酶系统称为工具酶。工具酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。
Ⅲ型酶的作用方式 (引自Lewin,1997）
三、 限制性核酸内切酶的命名原则
用来源菌株属名的第一个字母（大写）和种名的前 两个字母（小写），构成基本名称。表示寄主菌的 物种名。（斜体)
一个字母（小写）代表菌株或型 。 若酶存在于质粒上，则需大写字母表示染色体以外
成分 同一菌株中存在不同的酶，用罗马数字顺序编号I,
甲基化使得靶位点不被内切酶切割掉。
（四）限制与修饰机理
限制与修饰由三个基因位点所控制： hsd R, hsd M, hsd S
➢ hsd R--编码限制性内切酶 ➢ hsd M--编码限制性甲基化酶 ➢ hsd S--控制两个系统的表达：协助上述两
种酶识别特殊的作用位点
由甲基化 酶和限制 性核酸内 切酶两种 酶活性配 合进行的
时间：1950’
人物与材料： ➢ T偶数噬菌体（Luria） ➢ λ噬菌体 & P2噬菌体(Bertani & Weigle）:更 具代表性和普遍性
请看实验
K、B具有核酸内切酶，能将外源DNA切断，保护自 己的方式是在这些内切酶的位点上进行甲基化；
甲基化的方式：N6甲基-A或C5甲基-C。
C不具有核酸内切酶。
核酸水解酶类 核酸合成酶类 核酸修饰酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶
磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
基因工程常用工具酶
➢ 限制性核酸内切酶 ➢ DNA连接酶 ➢ DNA聚合酶 ➢ 核酸酶 ➢ 核酸修饰酶
分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的
杂合位点（hybrid site)：由一对同尾酶 分别产生的粘性末端共价结合形成的位 点。杂合位点一般不能再被原来的任何 一种同尾酶所识别。
MunI：5` - C A A T T G - 3`
同裂酶
同尾酶
5`---GGATCC---3` 3`---CCTAGG---5`
Bam ---3`
3`---C CTAG
G---5`
5`---AGATCT---3` 3`---TCTAGA---5`
Bgl II
5`---A
GATC T---3`
3`---T CTAG
A---5`
特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
“分子胶”
⒉ DNA连接酶——促使具有互补粘性末端或平
头末端的载体和供体DNA片段连接，形成重组DNA分 子。
第一节 限制性核酸内切酶 Restriction enzymes
“分子 剪刀”
限制性核酸内切酶 — 在DNA上核苷酸的特定连
宿主的限制与修饰的作用： （1）保护自身DNA不受限制（修饰后）， （2）破坏入侵的外源DNA（限制作用）。
基因工程中采用没有限制作用的菌株作受 体，使基因操作得以进行。
➢ r-M+限制缺陷，具有修饰作用。 ➢ r-M-限制缺陷， 修饰缺陷。
二、限制性核酸内切酶的分类
I类酶的作用方式 (引自Lewin,1997)
回文结构（Palindromic）
大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形 式，即这些核苷酸对的顺序是回文结构。
不同限制性内切酶切割的三种结果
粘性末端(blunt ends )
5′粘性末端 3′粘性末端
平头末端(blunt ends )
5′粘性末端
3′粘性末端
平头末端
五、同位酶与同尾酶
冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加 相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。
每一种酶都有各自特异识别位点
它对底物要求有特异 的序列，通常的识别序列 是4 bp ～6bp，有些则 为7bp～8bp，甚或多于 8bp。
多数限制酶的识别序 列为回文结构，在识别序 列内或其附近水解DNA链 中的磷酸二酯键。
同位酶(isoschizomer) ： 也称同裂酶，识别位点的DNA序列相同
的一类限制性内切酶（切点不一定相同）；
同尾酶(isocandamer) 酶切后产生的DNA粘性末端相同的一类
限制酶（识别位点序列不一定相同） 。如
BamHI, BclI,Bgl Ⅱ ,Sau3AI,XhoⅡ是一 组同尾酶。