菊花花瓣的组织培养摘要: 述菊花花瓣组织培养的备件、生长与分化情况及意义。

关键词: 菊花、花瓣、组织培养。

前言：植物组织培养的概念是指在人工控制的条件下，将植物体的任何一部分，或器官、或组织，或细胞，进行离体培养，使之发育形成完整的植物体。

所谓人工控制的条件，即营养条件和环境条件；植物体的任伺一部分是指根、茎、叶、花、果以及它们的组织切片和细胞。

它的优越性在于：可以在不受其他部分干扰的情况下研究被培养部分的生长和分化规律。

特点是：取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。

[1]植物组织培养与细胞培养开始于19世纪后半叶，当时植物细胞全能性的概念还没有完全确定，但基于对自然状态下某些植物可以通过无性繁殖产生后代的观察，人们便产生了这样一种想法即能否将植物体的一部分在适当的条件下培养成一个完整的植物体，为此许多植物科学工作者开始了培养植物组织的尝试。

最初的问题仍然是集中在植物细胞有没有全能性和如何使这种全能性表现出来。

植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性（totipotency）。

一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的遗传基础，在一个适当的条件下可以通过分裂、分化再生成完整植株，这就是所谓的细胞全能性。

[2]植物组织培养的基本方法是材料选择、培养基配置、接种与培养和最后的小苗移栽。

植物组织培养的应用 1、植物离体快速繁殖2、植物脱毒苗木培育3、植物新品种培育4、植物次生代谢产物生产6、人工种子5、植物种质资源的离体保存国内外研究进展1 植物组织培养的光源研究早在1991 年，维斯康星大学的Bula 等利用以红光660 nm 为发光中心的GAALAS LED 阵列及其辅助光蓝色荧光灯，栽培了GRAND Rapids lettace（lactucasativa L），这大概是世界上最早利用LED 作为光源进行植物栽培的试验实例。

经LED 光源处理的组培苗鲜重增量、碳酸酐酶活性以及叶绿素含量等明显高于对照的日光灯处理组培苗。

[3]2 无糖组织培养技术研究无糖组织培养是日本千叶大学古在丰树教授研究开发的一种新的植物组培技术。

他首先研究发现容器中的小植株也具有光合自养能力，从而考虑改变植株的营养方式以CO2作为植株的碳源，同时改善植株的生理和能量代谢，使植株更好地发挥自身的光合能力，降低生产成本。

3 植物组织培养的新型培养容器研究在传统的组织培养中，通常采用容积较小的培养容器以降低培养基中糖引起的污染，一般情况下容器中的空气流动性差，相对湿度高，CO2浓度低。

为了增强培养容器内外的气体交换、降低容器内的相对湿度，近年来有不少学者研究了利用高分子膜材料制成的培养容器的有效性。

[4]1.实验材料材料：在武汉市场购买的菊花，菊花花瓣呈黄色，取里层花瓣切块后接种于平底试管。

2.菊花的外植体的制备2.1培养基是组织培养能否成功的关键，随着研究工作的进展，培养基的种类越来越多，但其组成主要有：无机成分（大量元素：每升培养基中大于0.5mmol的元素；微量元素：每升培养基中小于0.5 m mol的元素）：硫酸铁；乙二胺四乙酸二钠盐；乙二胺四乙酸铁钠盐；硼酸；氯化钴；碘化钾；钼酸钠；无水氯化钙；二水氯化钙；干燥氯化钙；硝酸钙；N-泛酸钙；磷酸三钙；硫酸铜；硝酸胺；硝酸钾；结晶硫酸镁；硫酸亚铁；磷酸二氢钾；硫酸锰；硫酸锌；磷酸二氢钠；三氧化钼；氯化钾；氢氧化钾；硫酸铵。

有机成分：烟酸、肌醇、盐酸硫胺素（VB1）、盐酸吡哆醇（VB6）、甘氨酸、叶酸、蔗糖、琼脂粉。

激素：生长素：IAA（吲哚-3-乙酸）、NAA（α-萘乙酸）、2，4-N（2，4-二氯苯氧乙酸）等；细胞分裂素：6-BA（6-苄基腺嘌呤）、BAP（6-苄氨基嘌呤）、KT（激动素）、ZT（玉米素）等。

除上述必需成分外，还用到了琼脂，使配制的培养基凝固，便于操作；本实验选用MS基本培养基，6-BA、NAA两种激素配，加入蔗糖的琼脂固体培养基。

表2-1 MS培养基及其贮备液（mg/L）2.2灭菌物品:平底试管8支,蒸馏水200ml,解剖刀一把,镊子一把,平板8个,一套枪头。

其他器材: 酒精灯,打火机,废液缸,移液枪一套,篮筐，棉塞，棉线，超净台，称量纸，锥形瓶250ml，玻璃棒，报纸，剪刀，小刀，镊子。

2.3方法: 2.3.1 MS培养基的配制：先称取琼脂1.4g，蔗糖6g于250ml 锥形瓶中，再加150ml蒸馏水，讲锥形瓶在电炉上加热溶解。

溶解后在锥形瓶中加储备液Ⅰ10ml，储备液Ⅱ1ml，储备液Ⅲ1ml，储备液Ⅳ1ml，然后加水到200ml，用HCl或NaOH，调PH至5.8。

最后趁热分装于9支平底试管，棉塞封口。

2.3.2灭菌: 用高压蒸汽灭菌锅将上述物品灭菌,在121℃灭菌15min。

2.3.3加激素和外植体的消毒：在超净工作台上，趁热在每支试管加30ul 6-BA和10ul NAA，取菊花花瓣,用自来水洗2-3次，置于小烧杯中，用体积分数为70%的乙醇浸泡15-30s。

用无菌水清洗2-3次后，用质量分数为2%的次氯乙酸钠液中浸泡6-10min，用无菌水洗3-4次。

于灭菌过的培养皿上切成0.5×0.5大小的方块。

接种到平底试管诱导培养基中。

2.3.4菊花花瓣接种：插入菊花瓣,要注意使花瓣的形态学下端接触到培养基.每瓶接种2~3瓣,接种后将锥形瓶的瓶口在酒精灯火焰处转动灼烧一遍。

重新包扎封口，贴上标签。

2.3.5培养：将接种后的8支平底试管放在30℃恒温室培养。

20天左右就可以形成愈伤组织。

2.4后续：收拾台面，处理废弃物。

3.菊花的分化培养3.1试剂： 6-BA 2.0mg/ml,NAA 0.2mg/ml,储备液ⅠⅡⅢⅣ3.2灭菌的物品：平底试管8支,蒸馏水200ml,解剖刀一把,镊子一把,平板9个,一套枪头。

其他器材:酒精灯,打火机，用镊子，废液缸,移液枪一套, 篮筐，棉塞，棉线，报纸，超净台，称量纸，锥形瓶250ml，玻璃棒。

3.3方法： 3.3.1 MS培养基的配制：先称取琼脂1.4g，蔗糖6g于250ml 锥形瓶中，再加150ml蒸馏水，讲锥形瓶在电炉上加热溶解。

溶解后在锥形瓶中加储备液Ⅰ10ml，储备液Ⅱ1ml，储备液Ⅲ1ml，储备液Ⅳ1ml，然后加水到200ml，用HCl或NaOH，调PH至5.8。

最后趁热分装于9支平底试管，棉塞封口.[5] 3.3.2加激素和分化：在无菌操作室中, 趁热在每支试管加20ul 6-BA和20ul NAA。

然后用镊子取出图4中的愈伤组织，在平板上，用灭菌的蒸馏水清洗三次。

用小刀切成5×5mm的小块，用镊子放入平底试管里。

立即在酒精灯火焰处灼烧管口后塞上棉塞，报纸包扎标记。

3.3.3培养：将8支平底试管放在20℃培养室，光照下培养，直到发芽。

3.4后续：收拾台面，处理废弃物。

4、结果与讨论4.1图片结果4.1.1 菊花的诱导培养基 2周后图1 图2 图3图4 图5 图6从上图中可以发现图6中的愈伤组织完全死亡，无明显现象。

图2、3、4、5其他的生长良好,其中夹带着少许绿色组织，生长较为缓慢。

而图4 则生长旺盛，脱分化出大量的愈伤组织，呈一团浓绿组织。

4.1.2 菊花的分化组织基 2周后图7 图8 图9可以清晰看出与7中的菊花分化组织生长良好,能够看到有少许的小叶片.图8试管中的菊花组织上有部分开始褐化，颜色较淡。

图9为我们组万同学试管，此为诱导培养基并没有经过分化与生根培养，却长成了一株完整的植株，由此可见该菊花的愈伤组织经诱导培养后有一定的几率会形成完整植株。

4.2讨论可以在实验里看到了一些组织出现了褐化现象,其中褐变是指在组织培养过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也慢慢变褐而死亡的现象。

考虑到实验过程,可以发现褐化现象可能是以下的几个方面造成的：（2）菊花的生理状态菊花的状态不同，接种后褐变程度不同。

一般菊花的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也就越容易褐变，成龄材料一般均比幼龄材料褐变严重。

（4）培养基在初代培养中，培养基中无机盐浓度过高，会引起酚类物质大量产生，导致褐变。

（5）光照在采取菊花前，将接种后的初代培养的菊花在黑暗条件下培养，对抑制褐变发生也有一定的效果遮光抑制褐变的原因主要是由于氧化过程中，许多反应受酶系统控制，而酶系统活性受光照影响。

但是，暗培养时间过长会降低外植体的生活能力，甚至引起死亡。

（6）温度高温促进酚氧化，培养温度越高，褐变越严重，而低温可抑制酚类化合物氧化，降低多酚氧化酶的活性，从而减轻褐变。

在实验途中可以有几支试管倾倒在日光灯管上，造成了温度过高。

（7）培养时间材料培养时间过长，会引起褐变物的积累，加重对培养材料的伤害。

菊花随着培养时间的延长，褐变程度会加剧，甚至在超过一定时间不进行转接，褐变物的积累还会引起培养材料的死亡。

从可以的实验时间来看，可以的菊花的培养时间还不是很长，这个原因应该说是影响不大的。

6.实验建议: 6.1 实验注意事项： 1.无菌操作是最为关键的，预备室的清洗、培养基的配制和灭菌，外植体初步处理和接种等工作要灭好菌。

2.培养室要求光照、温度控制，以利于外植体的生长、发育。

3.在菊花组织培养中试剂的配制配方要熟记，避免不必要的错误。

6.2 在实验过程中老师可以控制每组的激素添加量，让全班一个大组的激素添加量形成交叉，能够横竖来比较。

因为我感觉在此次实验中，大家试管的成功率不是很理想。

参考文献: [1]植物组培网/［2］吴殿星，胡繁荣.植物组织培养.第一版.上海：上海交通大学出版社，2004.1[3] 邹英宁，李国怀．李组织培养研究进展(综述)[J]．亚热带植物科学，2005，34(4)：76—80.[4］王忠. 植物生物学.第一版.北京：中国农业出版社，2002.325~328[5]李浚明组织培养教程 2002。