应用酵母双杂交系统对Prp蛋白与 shadoo蛋白互作的研究
1诱饵质粒的构建 2猎物质粒的构建 3诱饵质粒与猎物质粒的可行性检验及互作
4结果分析
PRP蛋白：朊蛋白 PRNP：朊蛋白基因 Shadoo蛋白：与朊蛋白在N端结构上及其相 似的新蛋白 SPNR：Shadoo蛋白的结构基因
1
诱饵质粒的构建
往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物（prey）。
8、目前,常用BD基因有：GAL4（1-147）; LexA
(E coli转录抑制因子）的DNA-bd编码序列。
常用的AD基因有：GAL4（768-881）和疱疹病毒
VP16的编码序列等。
9、双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报
道株指经改造的、含报道基因（reporter gene）
⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。
1)由于某些蛋白本身具有激活转录功能。在酵母中表
达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋 白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。 2)某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基 因的表达， 产生"假阳性"结果。
C) 感受态细菌的转化
1)将DH5a感受态细胞从-70℃冰箱中取出,立即置于冰 水中,10min融化;
2)将10μL连接产物加入DH5a感受态细胞溶液中(超净
工作台进行),轻轻吹打混匀,冰浴30min。42℃水浴热
Hale Waihona Puke 激2min,此时切忌振荡,之后立即放入冰水中2min,再
37℃水浴5min;
3)将37℃预热的液体LB培养基800μL于转化的 菌液中,37℃ 110r/min振荡培养45min。
灭菌;实验所需的所有试管、培养瓶、离心管等均
要用去离子水彻底清洗干净,高温高压灭菌;
2)从LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5mL LB液 体培养基, 37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。 将该菌悬液以1:100的比例接种于50-100mL LB液 体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5; 3)细菌的收获:培养液冰浴5分钟后,4℃/5000g离心5 分钟;
相互作用
(2) Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统（reverse two-hybrid system）。这项技术的关键是报道基因 URA3的引入。URA3基因在这里起到了反选择的作 用, 它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。
Vidal等人在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合 位点。改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养 基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激体转
化a接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔
（lawn），再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板
上，原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍
体细胞才能在此平板上生长。单倍体细胞或虽然是二
倍体细胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的
都被淘汰。
转印
盒回收,按T载体试剂盒操作说明分别与pMD18-T载
体连接,4℃连接20h,连接体系：
pMD18-T载体0.5μL
PCR回收产物4.5μL Solution 5.0μL
总体积10μL
B ) DH5a感受态细胞的制备
用CaCl2法制备DH5a感受态细胞,方法如下: l)配制0.05mol/L CaC12 15%甘油混合溶液,高温高压
胞内的真实情况。
⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因
而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作
用。
⑷ 酵母双杂交系统可采用不同组织、器多种不同亚细胞部位及功能的 蛋白。
局限性及存在的问题
⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞 核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后 加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核 内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能 有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些 细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的
酵母双杂交系统具有许多优点：
1 易于转化、便于回收扩增质粒。
2 具有可直接进行选择的标记基因和特征性报
道基因。
3 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的
蛋白结合。
应用
发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响 建立基因组蛋白连锁图
4)此间制备LB抗生素琼脂平板,取出50℃预热的
灭菌的LB琼脂培养基按终浓度50μg/mL加入
Ampr 抗生素,摇匀切忌产生气泡,将培养基倒
入灭菌的平皿中,15~20mL/平皿。2min后凝
固,盖上平皿作好标记备用;
5)将37℃培养40-60min的转化菌液在超净工作台 中,每平皿100μL菌液的量轻轻加到己凝固的LB琼 脂培养基表面,应用无菌玻璃涂布器涂匀,37℃培 养箱放置几分钟(约10min),待液体吸收后,倒置培
（3）酵母双杂交实验转化效率太低，可以采用以下方
法解决：
1) 检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇
纯化。
2) DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。
3) 培养基不适当，重新配制培养基，并做对照转化。
4) 检测pGBT9对照载体的转化效率，放置于SD/–Trp平 板上，转化效率应该在1 x 105 colonies/mg DNA以上。
常见问题的解决方案
1、为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和 靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。目前几个公 司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因，且每 个报告基因的上游调控区各不相同，这可减少大量的 假阳性。另外，报告基因通常整合到染色体上，可以
使基因表达水平稳定，消除了由于质粒拷贝数变化引
（3）一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模
体（motif）如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互
作用。
酵母双杂交的优化
(1)在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a
接合型和α接合型，这两种单倍体之间接合
（mating）能形成二倍体，但a接合型细胞之间或α
接合型细胞之间不能接合形成二倍体。
Bendixen等人根据酵母有性生殖的这一特点，他们将
转录激活域（Activation domain,AD).
1 DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并与之结合。 AD则通过与转录机构（transcriptionmachinery） 中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游 的基因进行转录. 2 DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反 应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完 整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子， 使启动子下游基因得到转录.
起基因表达水平波动而造成的假阳性。
2、即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间 的相互作用，还应对以下方面进行分析：
（1）这种相互作用是否会在细胞内自然发生，即这
一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间 表达且定位在同一区域。 （2）某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径 的成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。
6、酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的
表达，探测蛋白－蛋白的相互作用。编码一个蛋白的
基因融合到BD；另一个蛋白的基因融合到AD。
7、Fields建立的双杂交系统，BD与X蛋白融合，AD与
Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，使
GAL4两个结构域重新构成，则会启动特异基因序列的
转录。一般地，将BD-X的融合蛋白称作诱饵(bait)，X
提取Balb/c小鼠肝脏基因组作为模板进行PCR,模板4μL,
引物各1μL,dNTP4μL，Ex-Taq 0.5μL,dH2O 12μL,ExTaq Buffer 2.5μL;
按95℃预变性5min, 94℃30s; 65℃30s; 72℃30s, 循环30次扩增; 最后72℃延伸10min,
反应结束后经1.0%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分 析鉴定
养过夜12-16h,直至出现转化菌落。
D) 重组质粒的小量提取 按 Vitagene生物公司开发的柱离心式琼脂糖凝胶 DNA质粒小量提取试剂盒进行操作,将所提质粒DNA 在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳,紫外灯下观察质粒提 取情况并拍照,并贮存于-20℃
(3)在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴 性现象。所谓假阴性，即两个蛋白本应发生相 互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以 至于检测不出来。目前假阴性现象虽不是实验 中的主要问题，但也应予以重视。
造成假阴性的原因主要有两方面。 （1）是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时 应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载 体。 （2）是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏 感的菌株及多拷贝载体。
相互作用
不相互作用
缺乏尿嘧啶的培养基
在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和 “猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。 然而如果与DB或AD融合的蛋白质发生了突 变或者由于外加药物的干扰不再相互作用， URA3基因不表达，则细胞能在含有5-FOA 的完全培养基上生长。
不相互作用
相互作用
含有5-FOA的完全培养基
酵母双杂交
基本思想
1 酵母双杂交由Fields在1989年提出. 他的产生是基于对真核
细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究. 2 GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域. 位于N端1-147位氨基酸残基区段的 DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）