高通量药物筛选一，概念高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。

二. 高通量筛选技术体系的组成 1. 化合物样品库化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。

其中,人工合成又可常规化学合成和组合化学合成两种方法。

2.自动化的操作系统自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。

操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了的图示代表机器的动作。

自动化操作系统的工作能力取决于系统的组分，根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。

3.高灵敏度的检测系统检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。

4.数据库管理系统数据库管理系统承担4个方面的功能: 样品库的管理功能;生物活性信息的管理功能; 对高通量药物筛选的服务功能; 药物设计与药物发现功能。

三. 高通量筛选模型常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。

1.分子水平的药物筛选模型:受体筛选模型;酶筛选模型;离子通道筛选模型 1.1受体筛选模型:指受体与放射性配体结合模型。

以受体为作用靶的筛选方法,包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。

1.2酶筛选模型:观察药物对酶活性的影响。

根据酶的特点,酶的反应底物,产物都可以作为检测指标,并由此确定反应速度。

典型的酶筛选包括1) 适当缓冲液中孵化;(2)控制反应速度,如:温度,缓冲液的pH值和酶的浓度等;(3)单时间点数器, 需测量产物的增加和底物的减少。

1.3离子通道筛选模型: (1)贝类动物毒素的高通量筛选,其作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素结合位点，用放射性配体进行竞争性结合试验考察受试样品。

(2)用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道β3亚单位与α1β亚单位相互作用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。

2.细胞水平药物筛选模型观察被筛样品对细胞的作用,但不能反映药物作用的具体途径和靶标,仅反映药物对细胞生长等过程的综合作用。

包括: 内皮细胞激活; 细胞凋亡; 抗肿瘤活性; 转录调控检测; 信号转导通路; 细菌蛋白分泌; 细菌生长。

高通量筛选技术与传统的药物筛选方法相比有以下几个优点:反应体积小；自动化；灵敏快速检测；高度特异性。

但是，高通量筛选作为药物筛选的方法,并不是一种万能的手段，特别是在中药研究方面，其局限性也是十分明显的。

首先，高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，因此任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；其次，用于高通量筛选的模型是有限的和不断发展的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。

但我们应该相信，随着对高通量筛选研究的不断深入，随着对筛选模型的评价标准、新的药物作用靶点的发现以及筛选模型的新颖性和实用性的统一，高通量筛选技术必将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作用。

高通量筛选技术采用的先进检测方法光学测定技术。

近年来，美、英两国研究人员在高通量筛选检测中，努力进行了光学测定方法的研究，建立了大量的非同位素标记测定法，如用分光光度检测法筛选蛋白酪氨酸激酶抑制剂、组织纤溶酶原激活剂等，均获得成功。

放射性检测技术。

美国学者GanieSM在高通量药物筛选研究中，应用放射性测定法，特别是亲和闪烁（SPA）检测方法，使在96孔板上进行的样本量实验得到发展。

该方法灵敏度高，特异性强，促进了高通量药物筛选的实现，但存在环境污染问题。

荧光检测技术。

美国学者GiulianokA研究认为，采用FLIPR（fluor ometricimaging readet）荧光检测法，可在短时间内同时测定荧光的强度和变化，对测定细胞内钙离子流及测定细胞内pH和细胞内钠离子流等，是非常理想的一种高效检测方法。

多功能微板检测系统。

由西安交通大学药学院研制的1536孔板高通量多功能微板检测系统，是目前国际上先进的高通量检测系统，它可使筛选量进一步提高，现已在该院投入使用。

1．基本原理高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理。

它的正常开展需要有一个高容量的化合物库、自动化的操作系统、高灵敏度的检测系统、高效率的数据处理系统以及高特异性的药物筛选模型。

1.1 化合物样品库高通量筛选是一种利用已有的化合物进行的体外随机筛选。

因此通过高通量药物筛选发现先导化合物(leading compounds)的有效性取决于化合物样品库中化合物的数量及其质量。

化合物样品的数量是指不同样品的数量。

化合物样品的质量主要由化合物结构的多样性决定的。

许多活性反应基团(reactive groups)使初筛的假阳性大量增加，剔除这些化合物可以提高化合物样品库的质量。

化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。

人工合成又可分为常规化学合成和组合化学合成两种方法。

采用常规化学合成的纯化合物一直是国外制药企业建立化合物样品库的主要来源。

它们通过长年积累的化合物建立化合物样品库，通过购买和化合物交流使化合物样品库的数量和质量大幅度提高。

组合化学(combinatorial chemistry)的出现为大量增加化合物的数量提供另外一种来源。

组合化学的基本原理是采用适当的化学方法，在特定的分子母核上加入不同的基团，在同样条件下，产生大量的新化合物。

这种方法在化合物的结构改造和优化方面已经表现出强大的优势。

但是，由于该方法是基于母核结构的改造，因此产生的大量化合物在结构多样性方面尚有极大的不足。

解决组合化学产物结构多样性的问题，已经成为化学研究人员的研究课题。

从天然产物中分离出来的化合物，母核结构和活性基团是长期的自然选择形成的，它们通过高通量筛选所表现出来的生物活性在药物发现中具有人工合成化合物所不能比拟的优势。

因此，增加样品库中具结构多样性的天然化合物及其衍生物是提高样品库质量的一个重要途径。

跨国制药企业为了增加高通量筛选的阳性率，已经或正在寻求助买我国的天然产物单体。

1.2 自动操作系统高通量药物筛选每天要对数千化台物样品进行检测，工作枯燥、步骤单一，人工操作容易疲劳、出错。

自动化操作系统采用微孔板作为反应容器，具有固定的分布模式(format)；不同的微孔板通过条形码加以标记。

自动化操作系统通过光电阅读器对特定的微孔板上的特定位置进行操作，并将操作结果及相关数据存贮在计算机内，使筛选结果准确，实验过程快速。

自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。

操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了的图示代表机器的动作。

编程过程简洁明了，可操作性强。

自动化操作系统的工作能力取决于系统的组成都分，根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。

除了实验步骤的需要以外，自动化的加样方式是决定筛选速度的重要因素。

目前主要有单孔、8孔、96孔、384孔等几种方式。

单孔一般用于对照样品以及复筛中零散样品的转移。

96孔、384孔在酶活性检测以及需同时开始、同时终止反应的筛选模型中是必需的。

自动化操作系统的一个重要组成部分是堆栈(hotel)。

所谓堆栈是指在操作过程中用来放置样品板、反应板以及对它们进行转移所需的腾挪空间。

因此，高通量筛选的样品数量取决于堆栈的容量。

由此可见，高通量药物筛选的自动化操作系统由计算机及其操作软件、自动化加样设备、温孵离心等设备、堆栈4个部分组成。

不同的单位可根据主要筛选模型类型、筛选规模选购不同的部分整合成为一个完整的操作系统。

1.3 检测系统快速、高灵敏度的检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。

在高通量药物筛选中，检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。

检测仪器灵敏度的不断提高，即使对微量样品的检测，也可以得到很好的检测效果。

1.3.1 液闪计数放射性同位素广泛用于受体结合测定、细胞毒性、细胞增殖实验、药物代谢示踪以及基因分析中。

由于采用了双光电倍增管及时间分辨偶合回路(time-resolved coincidence circuit)技术，有效地降低了背景信号的干扰，使测定灵敏度提高，同位素用量少。

在96孔板的分析检测中，背景信号可控制在10cpm左右。

亲和闪烁分析(scintil1ation proximity assay，SPA)是一种新的液闪分析法。

该方法在细胞表面受体药物筛选中应用较为普遍。

在高通量筛选测定细胞表面受体亲合结合作用时，放射配体标记滤过分析技术由于需要进行分离，现已被亲合闪烁分析所取代。

亲合闪烁分析技术通过亲合结合，将放射性配基结合到具有受体的闪烁球上，从而产生光子，减少了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分离过程，使得放射配基分析可完全以自动化的方式进行，适于进行高通量筛选。

产生低能量放射粒子的同位素可被用来进行放射性标记，而这种低能量放射粒子在短距离内可被重吸收，以确保只有结合到受体表面的配基才被检测到。

SPA技术被广泛的应用到激酶、核酸处理酶分析以及受体配体的相互作用分析中。

1.3.2 分光光度法为了适应高通量药物筛选，许多公司都生产了具备计算机接口并能对多孔板进行同时检测的分光光度计。

以Molecular Device公司的spectra 190为例，它采用8条光导纤维同时对8孔进行测定。

测定波长以2nm为间隔，可以在190nm一850nm间进行选择。

对未知物质，可在该范围内进行扫描以确定其特征吸收光谱。

因此，大大增加了建立模型的多样性。

检测数据以不同文件格式输出，可用随机软件或通用数据处理软件进行处理。

方便、快速、准确、自动化程度高。

分光光度法高灵敏仪器同自动化操作系统的连接，使得基于紫外、可见光谱的高通量药物筛选模型成为主要模型种类。

1.3.3 化学发光检测化学发光指生色物质在酶促作用下，化学能以光子的形式释放出来。

化学发光根据发光的形式和种类分为辉光型和闪光型发光两种。

辉光型化学发光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等为基础的发光反应。

其发光时间较长且稳定。

而以发光蛋白、ATP、荧光素酶等为底物的发光反应则是闪光型发光反应，其发光时间较短。

由于时间分辨及偶合回路技术的使用，对于背景的去除更为有效，使得化学发光的检测灵敏度达到0.1pg数量级。