—、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。

二、 引用标准：《中国药典》(通则1105-1106) 三、 目录1.微生物限度标准2.设备.仪器及用具3・消毒液、稀释剂.试液及培养基4. 检查总则(通则1105:非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法)5. 微生物计数法检查6. 控制菌检查法7. 实验技术&附件1. 微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准*未做统一规定。

L1成品微生物限度标准(1).” 一”为不得检出。

(2).目测霉变者以不合格论。

(3).”无”为标准依据或无相应规定。

1.2工艺用水微生物限度标准1.3内包装材料微生物限度标准说明：1・”一”为每100 cm2中不得检出。

2.目测霉变者以不合格论。

3.”无”为标准依据或无相应规定。

2.设施、仪器及用具2.1、设施：2丄1・微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区域、工作台直及环境应定期进行监测。

2.12其它设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30〜35©）;霉菌培养箱（25-280 ；电炉（或其它适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300匕）；电冰箱。

生化试剂储存箱。

2.2仪器及器mi2.2.1.菌落计数器；显微镜（1500X）;电子天平或药物天平（感量O.lg）; pH系列比色计。

222•玻璃器皿：锥形瓶（250〜300ml,内装玻璃珠若干）.研钵（玻璃或陶瓷制,f 10〜12cm）、培养皿（f 9cm）.量筒（100ml）.试管（18x 180mm）及塞、吸管（lml分度0.01, 10ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。

2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%〜2%盐酸（工业用）液中约2〜6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。

用于化学分析的玻璃仪器，需用重洛酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2〜3次，晾干备用。

2.3用过的玻璃器皿：231未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。

用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外，可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。

容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3 次。

232己被病原微生物污染的器皿：需先经过灭菌处理后再按常法洗涤。

试管及培养Ell：先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内，经121C灭菌30 分钟。

趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮净。

吸管：全部直立浸没于清洁液的长筒形容器中，筒底应衬有棉或橡皮垫，以防管尖损坏。

24小时后，逐支用流水重复冲洗洁净，晾干后包扎灭菌备用。

载、盖玻片：应分别浸泡于清洁液12〜24小时后，取出用流水冲洗, 再放入3%~5%肥皂水或5%碳酸钠液内煮沸10〜15分钟，待自然冷却后, 再用流水冲洗。

沥干后置95%乙醇中浸泡，晾干备用。

2,3,3玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。

吸管□上端距0.5 cm 处塞入约2cm 的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。

锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞（以免振荡时供试液污染瓶塞），再用牛皮纸包扎。

玻璃器皿，均于160*0干热灭菌2小时或高压蒸汽121C灭菌30分钟，烘干备用。

2.4用具2.4.1大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%〜75%乙醇溶液浸泡）O242无菌衣、帽、□罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。

也可用一次性无菌衣、帽、□罩、手套。

2.4.3接种环（白铉金或镇辂合金，环径4〜5mm、长度6〜10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌银子、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔.白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12 cm）、实验记录纸等。

3消毒液.稀释剂.试液及培养基3」消毒液、稀释剂及试液。

3.1.1 0.1 %苯扎溟披溶液：供洗手、擦拭操作台面用。

3.1.2 5%石碳酸溶液：配制后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用，抑或选用其它适宜消毒液。

3.13 75%乙醇溶液：配好后制乙醇棉球，供擦手、擦拭操作工具用。

3.1.4. 0.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g,加水使溶解成1000ml, 121C 灭菌20分钟。

3.1.5.司盘・80、单硬脂酸甘油醍、吐温・80:供非水溶性供试品供试液制备用。

3.16无菌0.1 %氯化三苯四氮0坐溶液（TTC）:取氯化三苯四氮呼O.lg,加水使溶解成10 ml。

3.1.7.甲基红指示液：取甲基红O.lg,加入95%乙醇300ml,水适量，使溶解，再加水至500ml o3.1.8. V-P试液：①氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g,加水使溶解成100ml;②a ■奈酚乙醇试液：取a -奈酚6.0g,加无水乙醇使溶解成100ml o3.19革兰染色液：①沙黄染液：取沙黄0.25g,加95%的乙醇10ml,使完全溶解后，加水至100ml;②结晶紫染液：取结晶紫l.Og,加95%的乙醇20ml,使溶解，加1%的草酸钱溶液80ml,混匀。

静置48小时使用，置密闭棕色瓶中储存；③碘试液：取碘化钾2.0g,加水3〜5ml使溶解，加入碘片l.Og,使全部溶解后，加水稀释至300ml,置密闭棕色瓶中储存。

3.1.10.中性红指示液：取中性红l.Og,研细,加95%乙醇60ml,使溶解, 再加水到100ml o 变色范围pH6.8〜8.0（红〜黄）。

3.1.11.亚甲蓝指示液：取亚甲蓝0.5g,加水使溶解成lOOmlo3.1.12.漠麝香草酚蓝指示液：取漠麝香草酚蓝0.4g,加lmol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水至lOOmU变色范围pH6.0〜7.6（黄〜蓝）。

3.1.13.酸性品红指示液：以酸性品红0.5g,加水100ml使溶解，再逐渐加lmol/L氢氧化钠溶液16ml,每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第二滴, 直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟，再静置2小时，滤过，即得。

优点：无色，在倒管内早期发酵易观察，不易被还原。

变色范围pH6.0~7.4（红一黄）o3.1.14.曙红钠指示液：取曙红钠2.0g,加水使溶解成lOOmlo3.1.15.靛基质试液：取对二甲氨基苯甲醛l.Og,加入95%乙醇95ml,充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。

3.2培养基321 .培养基的制备及储存3,2丄1溶化：一般应放在玻璃器皿或搪瓷器内。

加入纯化水，隔水加热以促其溶解，加热时应经常搅拌，防止焦结，待其溶解后补足水分。

3.2.1.2在使用干燥培养基时，先将纯化水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉放入水中，静置10〜15分钟，搅拌，振荡，或延长时间以促进溶解，一般不要加热，必要时加热，但时间不宜过长，温度不宜过高, 避免某些营养成分被破坏。

3.2.1.3校正酸碱度：培养基必须有适当的pH值。

测定pH值是培养基配制过程中的重要步骤之一，干燥培养基一般己校正过pH值，用时也必须再验证。

pH值测定时，一般用指示剂滴入培养基中观察其颜色的变化，或用pH计校正，如与所需pH值不符，可用酸或碱液加以校正。

一般用氢氧化钠校正的弱碱性培养基，高压灭菌前培养基的pH值高0.2左右，灭菌后基本合适。

调整pH值后要加热过滤，使培养基澄清。

322培养基的分装：322.1液体、半固体培养基一般在高压灭菌前分装，约装试管容积的1/3, 在灭菌后还要加入成分的液体、半固体培养基，灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中。

322.2固体培养基一般分装在250 ml、500 ml锥形瓶中，高压灭菌后根据需要分装平皿或试管。

平皿：如倾注平血，应在无菌室中放置3—4小时，如用塑料平ini须在35C培养箱中倒置30一60分钟。

水蒸气会自然蒸发。

斜⑥：制备低层斜廂分装于试管，约占容积的1/5,灭菌后趁热斜放于细玻璃棒和木杆上，使成斜度，分装时注意管□和瓶塞上勿沾有培养基，避免污染。

制备高层斜廂分装于试管，约占试管容积的1/3,灭菌后趁热放置成高层短斜面，待其凝固后应用。

323培养基的灭菌：培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭菌，各种培养基的灭菌时间和压力，按其成分不同而定。

普通培养基多采用1210、103.42kPa灭菌15分钟，但容器和装量较大时，可延长至20分钟。

高压灭菌应严格按照操作规程逬行，必须逐渐加热，彻底排除灭菌器内的冷空气，再逐渐升压保持预定的压力和时间，达到全杀灭微生物的目的。

324培养基的储存：保存培养基的时间需视培养基中水分蒸发的程度及有无污染而定，已制备好培养基要保存于冷暗处或冰箱中，但由于各种培养基的性质不同，不可能固定一个保存期限。

制备好的平板或试管培养基，为防止水分蒸发，应置于塑料袋内,4住保存，㊁延长使用期限。

微量生化反应管熔封于细玻管内, 室温下可保存1年左右。

3.3注意事项：3.3.1采用干燥培养基时，按说明配制，应对灭菌后的培养基pH值进行校验。

若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂的用量。

试剂规格要求应为化学纯（CP）以上规格，其中不能含有对细菌、霉菌、大肠杆菌生长有害的抑制物。

3.3.2配制的培养基不应该有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，并应于2小时内灭菌，避免细菌繁殖。

3.3.3培养基的分装量不得超过容器的2/3,以免灭菌时溢出。

包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。

334配制培养基的pH值测定时，其波动范围应在规定的pH ±0.2之内, 还需注意高压灭菌后的pH值变化。

3.3.5每批培养基均应有配制记录，包括名称、配制量（各种成分用量）、配制者、校对者、配制日期以及性能和无菌试验。

3.3.6每批培养基在用于样品的分离鉴定之前均应作性能试验，以保证微生物检验的质量。

性能试验须用已知标准菌株进行预试，符合要求方可应用。

3.3.7棉塞以普通棉花制作，棉塞松紧应适宜，过松易污染杂菌，过紧影响透气性；每次用后需高压灭菌并随即烘干，要防尘、防霉；变硬无弹力时需更换。

3.3.8各种试管应先配上合适的棉塞，待高压灭菌后再分装培养基，可防止污染。

339培养基配制时，应先将有沉淀物的原料如蛋白月东、牛肉膏.盐类和琼脂配好，经调节pH值、加热并煮沸溶化后再滤清；滤清时注意趁热过滤，滤除异物、沉淀后，应将蒸发失去的溶液量按原溶液量加纯化水补足。

3.3.10应严格遵守各种培养基规定的灭菌温度和时间，灭菌后培养基不得有混浊现象，每瓶配制并灭菌后的培养基.稀释剂均应在外表清楚标明灭菌日期。