低温诱导植物细胞染色体数目加倍
一、实验目的
1．了解人工诱导植物多倍体的原理、方法及其在植物育种中的作用。
2．应用植物染色体制片技术，鉴别诱导后染色体数目变化。
3．学会探究性实验的设计方法。
二、实验原理
通过低温阻碍细胞内酶促反映的进行，从而导致细胞分裂时形成纺锤体所需ATP的供应途径受阻，使细胞分裂过程中完成染色体加倍而细胞不能分裂，达到染色体数目加倍。
从理论上讲，观察染色体数目的最佳时期是分列中期，可当纺锤体的行成受到抑制时，细胞分裂就停止在了前期，不再出现中期、后期，只有当细胞分裂进入到第二周期的中期时，才能确保低温诱导染色体数目变化的成功。
因此，低温处理的时间至少要有一个半周期的时间。
低温抑制了纺锤体的形成，同时也降低了酶的活性，细胞分裂的速度减慢，细胞周期会延长。
三、实验仪器与试剂
1.材料：蚕豆
2.试剂：秋水仙素
3.仪器：超低温冰箱
四、实验步骤与方法
（1）培养根尖蚕豆种子于30℃～40℃水浴中浸种3 ～4h 后，取出放入带有湿润纱布的培养皿中于10℃培养，每2d 换一次水。
注意水要浸过蚕豆种子体积的1/3。
(2)低温诱导处理待实验材料长出约1cm 左右根时，将实验材料平均分两组: 实验组于2℃的冰箱中进行低温诱导培养36h 后( 换水时注意用2℃的水，减小实验的误差) ，于15℃～20℃恢复常温培养10 ～12h( 即小于实验材料一个细胞周期的时间) 。
对照组于15℃～20℃常温进行培养，注意经常换水。
(3)取材、固定、解离、漂洗与染色常规“植物细胞有丝分裂”制片方法［1］。
(4)显微观察与数据统计分析随机观察并统计10 个视野中分裂期和非分裂期细胞，计算分裂指数( mitotic index，MI) 。
细胞分裂指数= 分裂期细胞数/全部细胞数×100%。
统计数据进行卡方检验。
五、实验记录
( 1) 培养根尖蚕豆种子于30℃～40℃水浴中浸种3 ～4h 后，取出放入带有湿润纱布的培养皿中于10℃培养，每2d 换一次水。
注意水要浸过蚕豆种子体积的1/3。
(2)低温诱导处理待实验材料长出约1cm 左右根时，将实验材料平均分两组: 实验组于2℃的冰箱中进行低温诱导培养36h 后( 换水时注意用2℃的水，减小实验的误差) ，于15℃～20℃恢复常温培养10 ～12h( 即小于实验材料一个细胞周期的时间) 。
对照组于15℃～20℃常温进行培养，注意经常换水。
3.取材：待蚕豆根尖长至2cm时取其根尖顶端（0.5-1cm）
4.预处理:将取下的根尖置于盛有对二氯笨饱和水溶液的青霉素瓶中，浸泡处理3-4 h。
5.固定：经过预处理的根尖，用水清洗，用甲醛-冰醋酸（3：1）固定溶液固定6-24h,固定材料可转入70%酒精中，于4℃冰箱中保存备用。
6.解离：倒去固定液，用蒸馏水漂洗2-3次。
7.染色：将根尖放在载玻片上，切下顶端1-2mm,滴加石炭酸品红溶液进行染色，5min 左右即可。
8.压片：盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散。
9.镜检观察：在显微镜下仔细观察，寻找染色体轮廓清晰、适中、分散而不重叠的分裂中期相。
10.封片：拔压好的染色体标本放在冰箱冷冻室，然后用刀片将盖玻片快速掀开，盖玻片和载玻片同时于37℃左右的烘箱中烘干。
载玻片、盖玻片经二甲苯透明，滴中性树胶，即制成永久制片。
载玻片、盖玻片分别用新的盖玻片、载玻片封片。
六、实验结果与讨论
1.本实验根据低温诱导染色体加倍和细胞同步化原理进行改进，即在常规低温诱导后，恢复常温培养，时间小于实验材料一个细胞周期，再进行后续有丝分裂临时装片制作。
镜检结果显示，实验组有丝分裂指数明显高于对照组( 图1、表1) 。
结果提示低温处理抑制纺锤体形成，细胞分裂就停止在了分裂前期，相当于细胞同步化过程。
恢复常温培养一个细胞
周期内，原本阻滞在分裂前期的细胞继续进行分裂，便出现一个明显的细胞分裂高峰，可见数量较多的分裂期细胞。
图1 蚕豆根尖实验组有丝分裂图及分裂期细胞
表1 蚕豆根尖常温培养与低温诱导细胞的分裂指数
注: 经卡方数据检验得: P ＜0．05，蚕豆根尖实验组与对照组细胞分裂差异显著。
2. 讨论
（1）恢复常温培养步骤的改进根据上述低温诱导染色体加倍和细胞同步化原理［1 ～4］，对本实验现有方案改进后，通过比较实验组和对照组的细胞分裂指数，使实验结果直观化、数据化，结果检验更加合理可信。
在中学教学中，学生通过该实验方案的操作，加深对低温诱导染色体数目变化本质的理解，并进一步延伸其在生产实践例如细胞同步化中的应用，从而在真正意义上达成知识与技能、过程与方法、情感态度与价值观三维目标。
（2）关于实验的细节问题具体讨论如下: ①选材前期工作通过比较多种实验材料，发现洋葱、蚕豆为本实验的理想材料。
首先两种常见植物为学生所熟知的，选取其作为实验材料，符合课程标准关于“注重与现实生活的联系”的课程理念; 其次蚕豆、洋葱的染色体数
目较少，染色体形态明显，易在显微镜下观察。
再者两者的根尖易培养，培养条件简单。
以蚕豆为实验材料的须注意:[5]①注意购买渠道。
建议从正规的种子公司购买当年的蚕豆种子，以保证种子的萌发率。
根据农作经验，蚕豆一般在暮春收种，当年入冬之后再次播种。
因此，在播种当年的秋天才可能购买到当年收获的新种。
教师应根据实验开展的时间，提前准备好蚕豆种子; ②注意培养温度。
蚕豆在初冬播种，因此其种子萌发的适宜温度大约是10℃。
而根据多数中学的教学进度，一般在入夏时开展本实验。
因此蚕豆培养需要在冷柜中保持10℃左右进行;③蚕豆在培养之前需要放在30℃～40℃的水浴锅中进行浸种，有利于蚕豆种子快速萌发。
待胚根萌发至1cm 左右，即根尖细胞分裂旺盛时，进行低温处理。
( 2) 低温诱导温度和时间及常温的恢复培养以洋葱和蚕豆为实验材料，低温处理的的最佳温度应控制在2℃～4℃。
关于低温诱导时间，应视具体实验材料而定。
现有资料对同一种材料说法也不一。
就本实验方案选用的蚕豆而言，低温诱导36h，细胞同步化效果最佳。
本实验方案关键步骤是低温诱导后恢复常温培养。
恢复培养的时间应严格控制在实验材料一个细胞周期以内。
这样，经前期低温处理同步化的细胞，在恢复常温培养后，才会出现一个明显的细胞分裂高峰。
如果恢复培养时间超过一个细胞周期，样品的细胞分裂指数将恢复为3% ～4%。
就本实验方案，由于蚕豆根尖分生区细胞细胞周期为17．3h[6]，因此建议常温恢复培养时间为10 ～12h。
( 3) 取材、固定、解离和染色建议取材后将根尖固定。
固定液能迅速穿透细胞，将细胞的形态固定并维持染色体结构的完整性，达到优良的染色效果[1]。
用固定液固定之后的材料要用95%的酒精进行充分冲洗，否则会影响实验材料的解离。
解离充分但不能过度。
具体时间根据不同的实验材料区别对待。
例如，蚕豆的根尖由于细胞壁比较厚，解离的时间要25 ～30min，也可以在30℃左右的水浴锅中进行解离。
洋葱根尖细胞常温解离的时间为20min。
染色之前要用蒸馏水将解离液冲洗干净，必要时可用0．5mol/L 氢氧化钠略洗以中和解离液，再用蒸馏水充分冲洗，以确保染色的效果。
建议使用改良苯酚品红染液，能够特异对细胞核染色，而细胞质几乎无色透明，易于观察。
染色时间一般为5min。
七、参考文献
［1］徐作英，王重力．2009．中学生物学实验教学论．北京: 北京师范大学出版社，321 ～322
［2］冯立新，肖桂芝，岳雪玲．2005．低温对人外周血淋巴细胞的同步化作用．承德医学院学报，22( 2) : 96 ～98
［3］毛春娜，张爱民，薛建平．2011．低温处理对半夏悬浮培养细胞同步化的影响．中国中药杂志，36( 8) : 959 ～963
［4］周爱文，柯铁，梅兴国．2001．低温诱导红豆杉细胞同步化的研究．武汉化工学院学报，23( 1) : 12 ～14
［5］张铭清，林荔，肖义军．2011．对“低温诱导植物染色体数目变化”实验细节上的补充．生物学通报，46( 9) : 56 ～57
［6］顾文波．2011．细胞周期与细胞同步化．生物学教学，36( 6) : 54 ～56.。