分子生物学实验设计实验题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ）学院：生命科学学院专业：生态学教师：吴传芳姓名/学号：余光辉/20 方成/20一、实验目的在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白二、实验流程三、实验试剂、材料及步骤(一)质粒DNA的提取1.原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求2.试剂LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。
溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖，10mmol/ EDTA-Na，25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ，2% SDS临用前1：1配制。
溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml冰醋酸11.5ml双蒸水28.5ml卡那霉素(20mg/mL)抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ）无水乙醇70%乙醇TE缓冲液或ddH2O3.材料含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液1.5ml塑料离心管EP管架微量取液器和取液器吸头常用玻璃器皿4.实验步骤（1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜（2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液（3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min（4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min（5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min（6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中（7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中（9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h（10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体（11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min（12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用5.注意（1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL（2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用(二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测1.原理在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。
当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开环。
但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。
2.试剂Gold view（DNA染料）0.5×TBE缓冲液上样缓冲液（6×）3.材料提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头4.步骤（1）琼脂糖凝胶板的制备：称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL0.5×TBE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。
待胶液冷却到650C（不烫手为宜），加入1μL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，（如右图）缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。
静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。
（2）加样：胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入0.5×TBE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL Loading Buffer（6×）混匀，加入胶板的样品小槽内（3）电泳：将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳（4）观察、拍照：将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带(三)DNA的限制性内切酶酶切1.原理限制性内切酶能识别并切割特异的双链DNA序列，其中：Bam HⅠ切割识别序列后产生的粘性末端：5'⋯ G↓GATCC ⋯3' →5'⋯G GATCC⋯3'3'⋯ CCTAG↑G ⋯5' →3'⋯CCTAG G⋯5'Not I切割识别序列后产生的粘性末端：5'⋯GC↓GGCCGC⋯3'→5'⋯GC GGCCGC⋯3'3'⋯CGCCGG↑CG⋯5'→3'⋯CGCCGG CG⋯5'2.试剂Not I, Bam HI, ddH2O，10×buffer，琼脂糖，Gold view3.材料提取的质粒pEGFP-N3和pET-28a ，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套4.步骤（1）分别去两支0.2mlEP管做上记号：如①②（（3）将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37℃酶切3h（4）取5μL ①②EP管的酶切反应液，同时取5μL原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果（5）按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段(四)DNA的连接1.原理ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。
具有相同粘性末端（同种酶切的片段）的DNA分子比较容易连接在一起，因为相同的粘性末端容易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构。
2.试剂T4DNA连接酶, ddH2O，T4DNA连接酶buffer3.材料酶切后的EGFP和pET-28a ，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套4.步骤（X ：Y = 1 : 3～10，用水补足20 μL（2）EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱160C反应过夜后，-200C 下保存用于转化(五)重组DNA的转化1.原理细菌处于容易吸收外源DNA的生理状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于00C，在有CaCl2存在的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经420C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达。
在选择性培养基上进行重组子的鉴定。
2.步骤（1）取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻，每200μL解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min（2）42℃热冲击60秒，立即置于冰浴5min（3）再在感受态细胞混合物中加入0.8mL的LB培养基，于370C摇床中培养1h（4）1h 后，6000r/min 离心3min，去掉上清（约留200μL的培养液），摇匀菌块（5）用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，37℃培养箱中倒置培养皿过夜（6）观察结果(六)重组子的鉴定提取质粒后，酶切鉴定EGFP(七)菌落PCR技术扩增目的基因片段EGFP1.原理PCR是在生物体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应，主要有变性—退火—延伸三个步骤组成高温变性-94℃下DNA双链解旋为单链；低温退火-55 ℃左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；中温延伸-72 ℃时，Taq酶以4种dNTP为原料，引物为复制起点，按5′→3′方向，复制模板的互补链。
按此循环（变性—复性—延伸），一般重复25~30次,短时间内，使目的基因片段扩增2n（n代表循环次数）。
2.试剂10×buffer，15 mmol/L MgCl23.材料DNA模板，4×dNTP，T7正反引物，Taq酶，琼脂糖，Marker DNA，吸头4.步骤（1）在0.2mL EP管内配制25μL PCR反应体系1个（2）用灭菌枪头挑单菌落接触EP管内，混匀瞬时离心（3）放入PCR仪中，设置反应程序（4）取9 μL反应液加1 μL10 ×loading Buffer做电泳检测，分析所得目的片段的大小(八)pET-28a-EGFP的表达1.步骤（1）取出感受态细胞BL21让其在冰上自然解冻，每200μL解冻的感受态细胞加入5μL pET-28a-EGFP质粒，混匀后冰浴30min（2）42℃热冲击90秒，立即置于冰浴5min（3）再将感受态细胞混合物转入0.8mL的LB培养基，于37℃摇床中培养1h。
期间将200μL的24mg/ml IPTG涂布在含Kana的LB培养基上，待用（4）1h 后，6000r/min 离心5min，去掉上清（约留200μL的培养液），摇匀菌块（5）用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含IPTG和Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，37℃培养箱中倒置培养皿过夜（6）观察结果(九)感受态细胞的制备1.挑一大肠杆菌单菌落放入3ml LB液体培养基（含Kan+），37℃培养过夜2.活化大肠杆菌：取3ml新鲜的LB液体培养基加入50-150μl的过夜菌，培养2-3个小时3.将昨夜摇出来的DH5α或BL21培养液转入离心管中,冰上放置10min,然后于4℃下4000rpm离心5min4.弃去上清,用预冷的0.1mol/L 的CaCl2溶液600μL轻轻悬浮细胞,冰上放置20min, 4℃下4000rpm离心5min5.弃去上清,加入300μL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置5min,即成感受态细胞悬液，可-80℃长期保存四、实验仪器恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL微量移液器各一支，台式高速离心机，制冰机，混合漩涡器电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。