微生物工程复习资料第一章绪论1、发酵工程发展过程中几个标志性人物和事件：1）1680列文胡克显微镜2）1857 巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起3）1897 毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精──酶4）1905 科赫固体培养基的发明，奠定了纯培养技术。

5）1928 弗莱明发现青霉素6）1953 Watson 和Crick 双螺旋结构2、发酵工程研究内容（5点）：1）微生物菌株选育——微生物菌株选育、改造与功能优化技术；2）发酵工艺——发酵过程优化、控制与反应器技术；3）单元操作——发酵工程过程工程技术；4）发酵产品分离提取工艺——发酵产品高效提取技术与装备；5）废物处理——绿色制造工艺的开发。

第二章工业微生物菌种的选育及扩大培养1、原生质体融合概念：就是把两个亲本的细胞分别去掉细胞壁，获得原生质体，将两亲本的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞质融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。

2、原生质体育种技术主要有哪些：融合、转化技术、诱变技术3、原生质体融合的方法和特点。

方法：1）硝酸钠法；2）高钙离子法；3）PEG法；4）多聚化合物法。

特点：1）大幅度提高亲本之间重组频率；2）扩大重组的亲本范围；3）原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大；4）可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中；5）用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。

4、原生质体融合的基本工程（步骤）：5、原生质体形成率和再审率（计算方法）：1）将用酶处理前的菌体经无菌水(或高渗溶液)系列稀释，涂布在完全培养基平板上培养，计出原菌数，该数值为A。

2）将用酶处理后得到的原生质体分别经如下两个过程处理：①用无菌水适当稀释，在完全培养基上培养计数。

由于原生质体在低渗透压下会破裂失活，所以长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数，该数值为B。

②用高渗透压液适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和，该数值为C。

原生质体形成率=%100⨯-A B A 原生质体再生率=%100⨯--BA B C 6、 菌种保藏原理及保藏方法：原理：主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。

一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。

保藏方法：1）斜面冰箱保藏法；2）沙土管保藏法；3）菌丝速冻法；4）石蜡油封存法；5）真空冷冻干燥保藏法；6）液氮超低温保藏法。

7、 种子扩陪的概念，目的以及标准：种子扩大培养：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。

这些纯种培养物称为种子。

目的：（1）接种量的需要，抑制侵染；（2）缩短发酵周期；（3）逐级适应。

标准：（1）生长活力强、同步性较好；（2）生理状态稳定，生产能力稳定；（3）总量及浓度满足要求；（4）无杂菌及噬菌体污染。

8、 种子扩陪的过程（实验室，生产车间）：1）实验室阶段：⑴培养物选择的原则：目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：对于不产孢子和芽孢的微生物，获得一定数量和质量的菌体；对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。

对于产孢子的微生物：①获得一定数量和质量的孢子:培养步骤少,因而更容易获得量和质稳定的种子,但操作繁琐。

②获得一定数量和质量的菌丝体:便于操作,但需要更仔细的控制。

⑵培养基选择的原则：培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。

在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。

⑶起始接种物的传代问题：目的：使菌种的传代次数尽可能的少。

细菌 保藏斜面 → 活化斜面产孢子 保藏 → 母斜面 → 子斜面2）生产车间阶段：⑴培养物的选择原则：在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。

菌丝体比孢子要有利：缩短发酵时间；有利于获得好的发酵结果。

⑵培养基选择的原则：目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。

在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本；二是驯化。

⑶发酵级数的确定：一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。

谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵发酵级数确定的依据：①级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响；②级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级；③在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。

⑷接种量的确定：接种后培养液的体积移入种子的体积接种量过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。

但是一般认为大一点好。

双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。

倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。

⑸种龄：种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。

原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。

⑹种子的质量要求：量：要求达到一定的浓度；质：形态(生长处于某个阶段、均匀等等)理化指标：C 、N 、P 的含量，pH ，酶活等；无污染。

9、 根据菌种特点，在实验室阶段，扩陪目的有所不同（对于产孢子与不产孢子而言）：1）对于不产孢子和芽孢的微生物——获得一定数量和质量的菌体。

2）对于产孢子的微生物——获得一定数量和质量的孢子；获得一定数量和质量的菌丝体。

1、 培养基类型：1）按培养基成分：合成培养基；天然培养基；半合成培养基。

2）按物理状态分：固体（固体；半固体；脱水）；液体。

3）按用途、类型分：基础培养基；完全培养基；富集培养基；选择培养基；鉴别培养基； 孢子培养基；种子培养基；发酵培养基。

2、 配制孢子培养基时应注意哪些方面：配制时需注意：A ）营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。

如灰色链霉菌在葡萄糖-硝酸盐-其他盐的培养基上都能很好地生长和产生孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只长菌体而不产孢子B ）所用无机盐的浓度要适量，否则会影响孢子量和孢子颜色。

C ）注意pH 和培养基的湿度。

3、常见的孢子培养基有哪些：1）麸皮培养基2）小米培养基3）大米培养基4）玉米碎屑培养基5）用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基4、工业上常用碳源、氮源（有机、无机、实速）各有哪些？氮源对发酵液pH产生的何种影响？碳源：糖类（最广泛的；葡萄糖最易被利用）、油脂、有机酸、低碳醇等。

氮源：有机氮源：豆饼（粕）粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、玉米浆、尿素等。

无机氮源：铵盐、硝酸盐等。

速效氮：无机氮源和尿素、玉米浆等可被迅速利用。

迟效氮：蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用。

氮源对发酵液pH产生的影响：(NH4)SO4® 2NH3 + H2SO4 NaNO3 + 4H2® NH3 + 2H2O + NaOH 反应中所产生的NH3被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质。

在常用的无机氮中，硫酸铵被菌体利用后会使培养液的pH下降，为生理酸性物质；硝酸钠被同化时则引起培养液pH上升，为生理碱性物质。

5、典型的无机盐和微量元素的功能：磷酸盐磷：是某些蛋白质和核酸的组成成分；磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用；微生物对磷的需要量一般为0.005～0.01mol/L。

常用K3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4。

硫：硫含硫氨基酸的组成成分，胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸。

某些产物的组成成分，青霉素、头孢霉素。

硫是构成一些酶的活性基。

硫酸镁加入培养基中，在碱性条件下会形成氢氧化镁沉淀，配料时要注意。

铁：细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化物酶等组成成分。

微生物有氧氧化必不可少的元素。

盐钾：不参与细胞结构物质的组成是许多酶的激活剂菌体生长所需钾量约为0.1g/L（以K2SO4计）。

微量元素：微量元素需量微少，但又不可缺少一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中，本身含有，不必另加，某些金属离子，特别是汞离子和铜离子，具有明显的毒性。

6、生长因子的概念、类别及哪些提供生长因子：生长因子：微生物生长不可缺少的微量有机物质。

类别：维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍生物。

提供生长因子的农副产品原料：玉米浆、麸皮水解液、糖蜜。

7、前提的概念：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而又较大的提高。

8、促进剂和抑制剂的概念：促进剂：促进剂是指那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

抑制剂：抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。

9、淀粉水解糖的制备方法（优缺点）（了解）：（1）酸解法：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。

优点：生产简易，由淀粉逐步水解为葡萄糖的整个化学反应过程，仅在一个高压容器内进行，水解时间短，设备生产能力大；缺点：1）由于水解作用是在高温高压条件下进行的，要求设备耐腐蚀、耐高温、高压；2）在酸水解过程中，除了淀粉的水解反应外，尚有副反应的发生，将造成淀粉的利用率降低；3）酸水解法对淀粉原料要求严格，淀粉浓度不宜过高。

（2）酶解法（双酶水解法）：酶解法可分两步：第一步：利用a-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖，使淀粉的可溶性增加，此过程称“液化”；第二步：利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖，此过程称“糖化”。

“液化”和“糖化”都是在酶作用下完成的，故得名。

优点：1）淀粉水解是在酶的作用下进行的，酶解反应条件温和，对设备要求较低。

2）微生物酶作用的专一性强，淀粉的水解副反应少，因而水解糖液纯度高，淀粉的转化率（出糖率）高。

3）可在较高淀粉乳浓度下水解，且可采用粗原料。

4）酶法制得的糖液色浅、较纯净、无苦味、质量高。

缺点：酶解反应时间较长（需2-3天），要求的设备较多，需具备专门培养酶的条件，由于酶本身是蛋白质，易造成糖液过滤困难。

（3）酸酶结合法：①酸酶法：特点：液化速度快；糖化是由酶来进行的，对液化液要求不高，可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率；用酸较少，产品颜色浅，糖液质量较高。