引物设计基本原则
• 引物的3’端尤其要避免重复的CG碱基序 列
• 二条引物的Tm值不能差别太大 ℃ Tm=2（A+T）+4（C+G）
• 合成引物时在其5’端可以加修饰成份 • 设计引物最好用电脑软件进行分析
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脱氧核苷三磷酸（dNTP）
• 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧 核苷三磷酸的混合物
PCR反应的特异性取决于退火时引物 模板的特异结合。退火温度一般低于引物 Tm50C左右，退火温度越高，产物的特异 性也越高；被扩增片段越大，退火所需时 间也相应延长。
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延伸温度与时间
延伸温度设为72℃， 因为Taq DNA聚合 酶在72℃时具较高的酶促活性，有利于DNA 的复制。延伸时间视产物长度而异，时间过 长易导致非特异性扩增。
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变性温度和时间
模板DNA充分变性是PCR顺利进行的前 提。在PCR扩增开始的第一次变性时， 应给 予足够的时间和温度，使基因组DNA充分变 性。一般在940C变性5～10 min。进入循环反 应后以94℃变性30～40s, 足以使模板DNA双 链变性。
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退火温度和时间
绝对定量 PCR
1. 外参照系统的设置 2. 内参照系统的设置
▪ 实时定量 PCR
对核酸扩增反应进行直接和动态的监测， 实现对靶基因的实时定量分析
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TaqManTM
3’
5’
5’
3’
Primers
d.NTPs
Thermal Stable
DNA Polymerase
R 5’
Probe
Q 3’
第二个循环
5’ 3’
4个拷贝
3’
5’ 3’ 5’ 3’
5’
3’ 5’
第三个循环
3’
5’ 3’
8个拷贝
5’ 3’
5’ 3’
3’
第n个循环 2n个拷贝
PCR的反应体系
参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和 缓冲液等。
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PCR的反应条件
• 反应温度（变性、退火、延伸） • 反应时间（变性、退火、延伸） • 循环次数（PCR效率及产物量）
耐热DNA聚合酶
添加反应混合液 及样本
加入试管中
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退火
变性
PCR原理
3’ 5’
3’
Taq
5’
Taq
3’
Taq
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循环
5’ 3’
延伸
5’ 3’
Taq5’
3’
继续延伸
PCR原理
3’ 3’ 3’ 3’
3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’
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5’ 3’
5’ 3’
10×
2.5 1×
25 mmol/L 2.5 2.5mmol/L
25 mmol/L 0.2 200mmol/L
1U/ml
1.0 0.04U/ml
100ng/ml
1.0 4.0ng/ml
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其它反应因素
• pH应保持在酶反应所需的最适pH • 盐浓度（引物与模板杂交率、杂交体稳定性
及聚合酶的活性） • 二甲亚砜（DMSO）能破坏模板的二级结构 • 牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶
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引物设计基本原则
• PCR反应的引物需要二条，分别设在被 扩增目的片段的二端，并分别与模板正 负链序列互补
• 引物的长度一般以18~25个核苷酸为宜 • 二条引物之间（尤其在3’端）的序列不
可有互补，以免形成引物二聚体 • 引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤
、 嘧啶碱基堆积
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配制PCR反应体系（例）
PCR反应体系(25ml) 去离子水 正向引物 反向引物 10×PCR反应缓冲液 镁离子 dNTP Taq DNA聚合酶 模板DNA
试剂浓度 体积(ml) 终浓度
15.8
10 mmol/L 1.0 0.4mmol/L
10 mmol/L 1.0 0.4mmol/L
的活性
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循环次数
• 重复次数一般设为25～35个循环 • 35个循环以后由于反应体系中各种反应组分的消
耗和反应副产物的产生，此时扩增产物量不再随 循环次数的增加而呈指数增长，即反应已处于平 台期
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PCR过程的实时监测
指数增长期 线形增长期 平台期
理论值
实际值
Log 产物DNA
聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction
PCR技术
• 由美国Cetus公司K.Mullis 于1983年建立 • 能在体外复制已知序列的DNA片段 • 具有扩增效率高和特异性强的特点 • 为生命科学领域的研究开创了崭新时代
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PCR原理
3’
5’
5’
3’
引物
d.NTPs
• 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 • 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异
性扩增也随之增加
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DNA聚合酶
• 从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖 噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取， 有很高的耐热稳定性
• Taq 酶的作用: 催化DNA合成。即在模板指导下，以dNTP 为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核 苷 酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链 沿
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循环数 #
Log 产物DNA
相对定量PCR
理论值 实际值
设计相对定量PCR实验方案时须注意： • 预先确定最佳模板量和PCR循环数，使所
采用的各反应参数在扩增指数范围内，避 免平台效物 的长度应有所不同，以保证电泳能将两者
分离开。 2021/3/3
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模 板 (template)
• 模板就是将要被复制的核酸片段（包括基 因组DNA和RNA、质粒DNA和线粒体DNA 等）
• 模板DNA须有较高的纯度 • 模板加入量影响PCR效率和产物的特异性
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引 物（Primers)
• 化学合成的寡核苷酸 • 能与模板特异地结合 • 引物决定产物的特异性和长度 • 引物设计时必须遵循一些原则
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镁离子浓度
• 镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应 系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性十 分重要
• 虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关， 但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及 鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离 Mg2+的浓度从而影响酶的活性。
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