大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化
一、实验目的
1）掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。

2）学习和掌握质粒DNA的转化和筛选方法及操作步骤。

二、实验原理
本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温实现转化。

由于所用pBS质粒带有长那霉素抗性基因。

因此可以通过长那霉素抗性来筛选转化子。

如果受体细胞没有转入pBS，则在含长那霉素的培养基上不能生长。

能在长那霉素培养基上生长的受体细胞肯定已经导入了pBS。

转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳酶切等进一步鉴定。

三、仪器及试剂
仪器：恒温摇床、CO2细胞培养箱、台式高速冷冻离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、移液枪、Eppendrof管。

试剂：LB培养基(在950mL水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl、用1mol/L NaOH调制pH=7.2.加入至1L，121℃高压灭菌20min)
长那霉素储存液：100mg/mL
含长那霉素的LB固体培养基：(1L LB液体培养基中加入20g琼脂粉，将配好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却至60℃左右，加入长那霉素储存液，使其终浓度为50μg/mL。

摇匀后铺板，每皿倒15mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净)
1mol/L CaCl2储存液质粒DNA10ng/Μl
四、实验步骤
1 感受态细胞的制备
1）从LB平板上挑选新活化的E.coli DH 5α单菌株，接种于3~5mL LB液体培养基中，37℃下震荡过夜培养，12h左右，直至对数生长后期。

2）将该菌悬浮液以1:50的比例接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h至OD600为0.5左右。

3）将5mL培养液转入4个1.5mL离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下，5000rpm离心5min。

4）弃去上清液，用预冷的1mL 0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15~20min后，40℃下5000rpm离心5min。

2 铺平板
将配好灭菌的LB固体培养基加热融化，待冷却至60℃左右后，加入长那霉素储存液，使其终温度为50μg/mL，摇匀后铺板，每皿倒约15mL。

室温放置过夜至冷凝水挥发干净。

3 感受态细胞的转化
1）取100μl感受态细胞悬浮液，加入5μLpBS质粒DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30min。

2）42℃水浴热激70s，热激后迅速置于冰上冷却3~5min。

3）向管中加入400μl LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃震荡培养1h。

使细菌恢复到正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

4）将上述菌液摇匀，取200μl涂布于含长那霉素的筛选平板上，正面放置0.5h。

待菌液完全被吸收后倒置培养皿，37℃培养16~24h，
5）对照实验：
对照组1：以同体积的无菌二次水代替DNA溶液，其他操作与上面相同。

此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2：以同体积的无菌二次水代替DNA溶液，取5μl菌液，稀释100万倍，涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

五、实验数据记录处理
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，各培养皿中的菌落数如下表所示：
平板序号DNA溶液无菌水抗生素稀释倍数菌落数
1+—+134
2+—+144
3—++10
4—+—1*106145
表 1 各平板数据记录
① 转化子总数=菌落数*稀释倍数*转化反应原液总体积/涂板菌液总体积
1号平板：转化子总数=34*1*505/200=86
2号平板：转化子总数=44*1*505/200=111
② 转化频率（转化子数/每毫DNA）=转化子总数/质粒DNA加入量(mg)
1号平板：转化频率=86/(50*10-6)=1.72*106
2号平板：转化频率=111/(50*10-6)=2.22*106
③ 感受态细胞总数=对照组2的菌落数*稀释倍数*菌液总体积/涂板菌液体积
4号平板：感受态细胞总数=145*106*505/200=3.66*108
④ 感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数
对1号平板：感受态细胞转化效率=86/(3.66*108)*100%=2.35*10-5%
对2号平板：感受态细胞转化效率=111/(3.66*108)*100%=3.03*10-5%
3号平板上没有菌落生成，说明未转化的细胞在有抗生素的环境中完全不能生存。

六、思考题讨论
1）感受态细胞：细菌收诱导后产生的一种短暂的、易于摄取外源DNA的状态。

2）CaCl2法制备感受态细胞的原理：细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物黏附于细胞表面，在经42℃短时间热休克处理，可制备成感受态细胞，促进细胞吸收DNA复合物。

3）制备感受态和转化细胞时注意事项（提高效率方法）：倒平板时应避免培养基温度过高，否则加入的抗生素会失效；OD600值需合适，即细菌应处于对数前期，对数中期；热激时间，热激温度需合适，且热激前加入相当于转化液体积1/10的DMSO可提高效率100倍左右，加入DMSO后不要剧烈振荡；实验过程中需
保证无菌操作、避免引入杂菌；涂板时应小心，防止细胞死亡。