生物技术通讯ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２００７综述文章编号：１００９－０００２（２００７）０２－０３３６－０３蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用李敏，周慧，崔银秋吉林大学生命科学学院生物大分子实验室，吉林长春１３００２１［摘要］蛋白质组学的新技术为我们研究细胞内的信号转导过程提供了更广泛和崭新的思路，它克服了传统技术的局限性，实现了对蛋白的高通量分析。
简要综述了蛋白质组学技术在信号转导过程中信号分子的确定、定量，磷酸化等翻译后修饰的识别，以及蛋白质之间相互作用研究等方面的应用。
［关键词］蛋白质组学；信号转导［中图分类号］Ｑ２５FＱ５０３［文献标识码］ＡＡｐｐｌｙｉｎｇＰｒｏｔｅｏｍｉｃＭｅｔｈｏｄｓｔｏＣｅｌｌｕｌａｒＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＬＩＭｉｎ，ＺＨＯＵＨｕｉ，ＣＵＩＹｉｎ－ｑｉｕＢｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅＬａｂ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｉｍｐｒｏｖｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｔｈａｔｈａｖｅｅｍｅｒｇｅｄｉｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｐｒｏｖｉｄｅｕｓｍｕｃｈｍｏｒｅｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅａｎｄｎｅｗｉｎ－ｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｔｈａｓｏｖｅｒｃｏｍｅｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｒｅａｌｉｚｅｄｔｈｅｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓｍｏｄｅ．Ｉｎｔｈｉｓｌｅｔｔｅｒ，ｔｈｅａｐｐｌｙｉｎｇｏｆｐｒｏｔｅｏｍｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｄｅｆｉｎｉｎｇａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｓｕｃｈａｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｒｅ－ｓｅａｒｃｈｄｕｒｉｎｇｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓFｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ２０世纪９０年代以来，对细胞内信号转导途径的研究逐渐成为国内外生物学界广泛关注的热点。
由于信号的传递在细胞的增殖、分化和生存等过程中都起着十分关键的作用，因而逐渐成为解决许多重要理论及实践问题的基本思路和有力武器。
近年来有关细胞信号转导研究的方法层出不穷。
传统地，人们主要利用ＲＮＡ干扰技术、抗体免疫沉淀、３２Ｐ标记结合蛋白质印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）等方法来检测和鉴定信号传递过程中差异表达的信号分子及关键蛋白的磷酸化。
这些方法和技术能够做小量的分析，但无法进行大规模的研究。
随着双向电泳（ｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２－ＤＥ）和质谱技术的不断完善与发展，蛋白质组学方法越来越多地被用于研究胞内信号转导过程。
它弥补了传统方法的不足之处，实现了高通量大规模的研究模式。
近年来，蛋白质组学方法应用于信号转导的研究，主要在对蛋白表达谱的检测和定量、翻译后修饰的识别，以及蛋白质之间相互作用图谱的绘制等方面。
蛋白质组学方法为我们完整地绘制细胞内信号转导网络图提供了更为可靠的依据。
以下就近年来该领域的一些新技术及应用做一简要综述。
１信号蛋白的寻找和确定细胞受到外界的刺激后，首先吸引许多锚定蛋白、衔接蛋白的结合，引起蛋白的相互作用，并随之引发胞内的一系列信号蛋白的改变（如级联磷酸化事件的发生），最终信号传递到核基因，表达或阻抑表达一些特征蛋白，或者作用于某些特定的细胞器，引发其他生物学效应。
由此可见，要了解一种信号途径的具体过程，首先要对该过程的特征信号分子及下游所表达的蛋白进行确定。
目前，二维电泳结合质谱技术（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ或ＥＳＩ－ＭＳ）已经成为蛋白质组学的首选工具，来获得不同状态下的细胞全蛋白质组。
许多研究通过选择性抑制或激活信号通路并筛选２－ＤＥ的效应分子成功地鉴定了信号转导过程中的靶标。
本文作者所在研究室［１］利用２－ＤＥ结合ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ，对处于不同生理条件下的ＮＩＨ３Ｔ３细胞的全细胞裂解液进行双向电泳分离及软件分析。
在我们筛选的ａＦＧＦ拮抗剂小肽存在的条件下，鉴定出３种表达量下调、１种表达量上升的蛋白，其中鸟苷酸结合蛋白α－１１亚单位和１Ｃ型核因子分别参与胞内ａＦＧＦ信号传导以及转录调控。
近来人们又开发出许多以２－ＤＥ为基础的改进方法，包括从样本制备、分离到染色等各方面，来对蛋白进行更好的分离分析，如亚细胞分离、差异凝胶电泳（ＤＩＧＥ）技术等［２］。
２－ＤＥ的优势是能够更直观地提供信号蛋白的相对分子质量、等电点、相对表达丰度等信息，但它在分离一些ｐＩ过大或过小、疏水性强的低丰度蛋白时有很大的困难。
最近研究较多的多维蛋白质鉴定技术（ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈ－ｎｉｑｕｅ，ＭｕｄＰＩＴ）［３］弥补了上述缺陷。
ＭｕｄＰＩＴ能够更有效地检测疏水蛋白，且在分析来自胞内细胞器的蛋白时具有更高的效率。
最常用的是二维液相色谱（２Ｄ－ＬＣ），它首先对蛋白复合物进行酶［收稿日期］２００６－０８－３０［基金项目］吉林省科技发展计划项目（２００４０４１１－３）［作者简介］李敏（１９８２－），女，硕士研究生［通讯作者］崔银秋，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｃｕｉｙｑ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ３３６图１质谱方法分析磷酸化肽的不同策略解，接着对酶解产物进行第一向离子交换色谱（ＩＥＸ）和第二向反向色谱（ＲＰＣ），最后用ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ测序。
目前该技术作为双向电泳的有利补充正越来越多地被人们应用。
２信号蛋白的定量研究细胞内的信号转导过程，不仅要确定表达类型改变的蛋白，还要对许多在表达水平上有所变化的蛋白进行定量。
在传统的定量方法中，研究者主要利用同位素标记（１８Ｏ，１５Ｎ，３２Ｐ）结合质谱等方法来定量特殊表达的信号分子，但是由于它们难以操作且造价昂贵而逐渐被人们舍弃。
１９９９年，Ｇｙｇｉ等［４］利用稳定同位素稀释原理发明了同位素亲和标签（ｉｓｏｔｏｐｅｃｏｄｅｄａｆｆｉｎｉｔｙｔａｇ，ＩＣＡＴ）技术，它利用质量差异确定的同位素分别标记差异表达的蛋白，可实现对蛋白质的定量。
这种新方法的建立为利用蛋白质组学研究信号转导提供了一个广阔的空间。
ＩＣＡＴ技术结合ＭｕｄＰＩＴ，已经被成功地用于许多领域，来反映由于信号分子的作用而引起的胞内信号蛋白表达与调节的变化，Ｓｈｉｉｏ等［５］就利用该方法分析了鼠成纤维细胞中５２８种蛋白在ｃ－ｍｙｃ信号转导中的差异表达，其中１／３以上显示了超过２倍的蛋白丰度改变。
最近又开发了细胞培养中的稳定性同位素氨基酸技术（ｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｉｎｇｂｙａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ，ＳＩＬＡＣ），该方法通过将一些非放射性的、同位素标记的必需氨基酸加入氨基酸缺陷的培养基中，在细胞生长时就自动并入蛋白中，之后再用质谱检测其相对丰度。
这种方法操作较简便，费用低廉，并可以对培养细胞中的全蛋白精确定量［６］。
３磷酸化修饰的识别在信号转导过程中，许多蛋白通过化学修饰来传递胞内信号通路并参与调节细胞的功能。
迄今，文献报道的翻译后修饰（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，ＰＴＭｓ）形式已有２００余种，如磷酸化、糖基化、法尼基化和蛋白遍在化等。
几乎５０％的蛋白含有一种或多种修饰作用来控制或调节它们的功能。
由于磷酸化修饰在胞内信号转导过程中具有“分子开关”的作用，许多信号途径的完成是通过某些关键蛋白的磷酸化来达到的，因而蛋白的磷酸化修饰逐渐成为研究的核心。
细胞内全部蛋白质大约有１／３时间处于磷酸化状态，且主要以磷酸化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的形式存在。
由于磷酸化蛋白的短暂存在、丰度较小等特点，使得它的富集和检测都变得比较困难。
在传统方法中，人们通常采用磷酸化肽特异性抗体或３２Ｐ标记来富集磷酸化蛋白，然而由于抗体的造价昂贵且难以生产、３２Ｐ标记引入了放射性且不易操作，使得在实验中产生许多困难。
随着质谱技术的飞速发展，人们摸索出一系列以质谱为主要检测手段，结合传统生化技术来检测和定位磷酸化蛋白质的方法，更加方便和准确。
图１［７］描述了这些方法的主要流程。
在磷酸化肽富集方法中，固定化金属亲和层析（ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄｍｅｔａｌａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＩＭＡＣ）［８］目前较多被人们采用。
磷酸基团与螯合在固相支持物上的金属离子（通常是Ｆｅ３＋或Ｇａ３＋，也有人用Ｃｕ２＋）通过离子对的相互作用被吸附，然后再洗脱下来。
该方法在大通量分析蛋白质磷酸化作用方面有着广泛的前景。
利用亲和色谱的方法，许多生物公司还开发了一些磷酸化蛋白纯化试剂盒，方便了人们的使用。
图１还介绍了一种Ｅｄｍａｎ降解的方法，未用到质谱，它利用Ｅｄｍａｎ磷酸基（３２Ｐ标记）释放测序的办法来检测磷酸基位点，结合生物信息学工具，也可以对磷酸化肽进行较好的分析［９］。
４蛋白之间相互作用研究在信号传递过程中，各种分子很少单独起作用，它们通常与胞内许多其他分子相互作用形成蛋白复合物来完成生物学功能。
因此，我们要研究信号转导的详细过程，就必须弄清这些复合物的组成分子及其功能。
在体外建立的最好的研究蛋白质之间相互作用的方法是酵母双杂交分析系统。
但是该系统不能检测相互作用的翻译后修饰，且其反映的只是相互作用的可能性，这种可能还需通过其他方法验证。
近几年来，利用蛋白质组学的李敏等：蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用３３７生物技术通讯ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２００７方法研究蛋白之间的相互作用发展很快。
最有效的是串联亲和纯化技术（ｔａｎｄｅｍ－ａｆｆｉｎｉｔｙｐｒｕｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＴＡＰ），ＴＡＰ技术是在没有破坏目的蛋白调控序列的基础上，于其一端或中部嵌入一段蛋白质标记（ＴＡＰｔａｇ），再经２步特异性的亲和纯化，与目标蛋白发生相互作用的蛋白质便可一起被洗脱下来，所得到的蛋白质复合体接着可以用质谱技术或Ｅｄｍａｎ降解法进行鉴定［１０］（图２）。
该技术提高了特异性，降低了背景蛋白的污染，获得了巨大突破。
利用该技术已经对酵母细胞的蛋白质相互作用进行了大规模研究，最近又成功地用于分析果蝇的蛋白质组，验证了一些已知Ｎｏｔｃｈ信号通路中关键的相互作用，并发现了许多新的相互作用［１１］。