第23卷第4期2005年7月泉州师范学院学报(自然科学)Journal of Quanzhou Normal U niversity(Nat ural Science)Vol.23　No.4J ul.2005蜜蜂转基因技术张巧利1,孙亮先1,郭冬生1,胥保华2(1.泉州师范学院模式生物研究中心,福建泉州　362000;2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安　271018) 摘　要:简述了建立蜜蜂转基因技术体系的方法和筛选标记.以显微注射法将改造过的pig2 gyBac、mariner等转座子转基因载体导入受精卵是蜜蜂转基因工作的最佳候选方案,精子介导法和病毒载体法也值得尝试.增强型荧光蛋白(EGFP)基因是转基因蜜蜂的最佳筛选标记.并对蜜蜂转基因技术体系在基因功能研究和生物反应器的开发等方面的应用前景进行了探讨.① 关键词:蜜蜂;转基因;载体;显微注射;转座子;精子 中图分类号:Q782 文献标识码:A 文章编号:1009-8224(2005)04-0094-06　蜜蜂是最重要的对农业有益的社会性昆虫,具有世代周期短(约28d)、繁殖力强(每只蜂王日产卵可达1500-2000粒)、行为复杂、孤雌产雄、可人工饲养等特点,已被作为一种新型的模式动物,用于研究免疫、过敏性反应、抗生素抗性、发育、精神健康、寿命和X染色体疾病等人类健康方面的问题.蜜蜂全基因组测序工作已经完成,2005年5月,基因组的拼接序列(version3.0)已经释放(http://www.hgsc.bcm.t ).蜜蜂的EST计划也已经开展,并被制备成cDNA芯片[1].这些成果表明蜜蜂研究已经进入后基因组研究时代.而作为基因功能研究的基本技术手段的转基因技术在蜜蜂上目前尚未成功建立.1982年,Rubin等开创性的以果蝇中的P-转座子作为载体将外源基因成功地转化进生殖系(germline)染色体,获得第一只转基因果蝇[2],经过20多年的研究,家蝇、蚊子、家蚕等多种昆虫的转基因体系先后被建立.本文综述了其他昆虫转基因工作中可供建立蜜蜂转基因技术借鉴的技术,并展望了该技术的应用前景.1　可用于蜜蜂转基因的技术1.1　显微注射技术显微注射是借助光学显微镜,直接把外源性DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、细胞或卵母细胞中,然后生产转基因动物个体.1980年,G ordon等人首次用显微注射的方法将纯化后的DNA注射进小鼠的晶胚,获得了转基因小鼠[3].在此后的一年时间内,共有六个实验室陆续报道通过向原核期的小鼠胚胎显微注射DNA,获得了转基因小鼠[4].从此,向原核①收稿日期:2005-04-09作者简介:张巧利(1979-　),男,山东巨野人,硕士生,从事动物营养与饲料科学研究.基金项目:国家自然科学基金项目(30300183);山东省博士基金项目(2004BS06014)期的胚胎直接注射纯化的DNA 作为生产转基因动物的方法被确立下来,到目前为止仍是一种比较可靠和经常使用的方法.蜜蜂的卵适于进行显微注射操作.蜂卵的受精是在蜂王向工蜂房或王台中产卵时发生的.产卵时,贮精囊受到巢房口挤压,精子通过卵孔进入卵,在2h 内精核与卵核发生融合,完成受精过程.据观察,蜂卵产下后在1—2h 内卵孔是开启的,利用这一特性,可在卵产下2h 内通过卵孔进行显微注射,从而避免损伤卵,又能在受精卵发生第一次卵裂前将携带外源DNA 的载体导入到卵内的合适位置便于转基因操作.但是,蜜蜂是一种高级社会性昆虫,幼虫需要工蜂来喂养.如果卵或者幼虫稍呈异常,就会被工蜂抛弃,给转基因幼虫的饲养带来不便.根据这一特性,可将已显微注射过的卵置于35℃、80%的相对湿度下培养65h 后再转入蜂巢孵化,并且尽量不对卵进行化学药品处理.1.2　精子介导法Brackett 等(1971年)发现精子细胞具有自发地吸收外源DNA ,并可在受精的过程中将外源DNA 携带进卵内[5].所以,可以用精子作为转移外源DNA 的载体,通过体外授精,将外源DNA 带入受精卵进而发育成个体,从而生产转基因动物.这一方法极为方便,避免了对卵原核的操作,符合生理受精过程,效率较高.1989年Lavit rano 等利用这一设想第一次成功地制备出转基因小鼠[6].他们用成熟的小鼠精子与p SV2CA T 质粒DNA 共同孵育15min 以上,二者结合后,在体外与小鼠卵授精,受精卵发育至2细胞阶段,移至假孕小鼠子宫中,待其生出小鼠后,用So ut hern blot 法检测了250只子代小鼠,其中30%携带并表达外源基因.该实验的成功开辟了转基因动物生产的新途径.1993年,Nakanishi 等利用精子转染法建立转基因鸡[7],Cappello 等利用该方法建立了表达人DA F 基因的转基因猪[8],Rott mann 等(1992)对上述精子载体法进行了改进,他们将外源DNA 在与精子共同孵育之前用脂质体包埋,脂质体与DNA 相互作用形成脂质体2DNA 复合体.这种复合体比较容易和精子细胞膜融合,从而进入细胞内部,改进以后的精子载体法在转基因鸡的制作上获得了满意的结果[9].对12日龄鸡胚用Sout hern 印迹杂交法检测发现转基因阳性率为26%,最理想的一次阳性率高达92%.实验还显示外源DNA 并未整合进宿主基因组,而是以附加体的形式存在于染色体之外.Per 2ry 等(1999)先将精子与外源基因共孵育1min ,然后将精子的头部显微注入M Ⅱ期的小鼠卵母细胞,在出生的后代小鼠中转基因阳性率可达20%以上,而且精子膜破损更有益于转基因动物的获得[10].蜜蜂上,At kinson (1991)首次将蜜蜂精子与外源DNA 进行了共培养[11],Robinson 等(2000)曾以精子为外源DNA 载体,通过人工授精将携带外源DAN 的蜜蜂精子导入蜂王贮精囊,并且在蜂王所产的后代中可以检测到外源DNA ,但发现外源基因未能整合进基因组[12].以精子作载体法的最大优点是方法相对简单易行,不需昂贵的显微操作设施及复杂的操作技巧.1.3　其他载体介导法在昆虫转基因研究历程上,曾经尝试过直接注射DNA 、基因枪法、精子DNA 载体法、母体注射法、电击法等多种方法,但效果均亚于转座子载体法和病毒载体法[13].Nagaraju 等(1996)将线状DNA 直接注射到家蚕卵内,结果几小时内外源DNA 就被降解或环化,不能整合进基因组中[14];Tamura 等(1990)将含有家蚕基因启动子的pBR322质粒导入蚕卵,发现质粒中的CA T 基因仅能瞬时表达[15].澳大利亚国立大学分子与群体遗传学研究组的John G ib 259　第4期张巧利等:蜜蜂转基因技术　69　泉州师范学院学报(自然科学)2005年7月　son与日本动物工业国家实验室的K iyo shi K imura曾在1997年进行合作,先后试图以P转座子及来自果蝇的Mariner转座子Mos1(mosaic21)为载体进行蜜蜂转化,但均未获得成功.其原因可能是由于他们所采用的转座子载体并不适合蜜蜂,即所用的载体系统与寄主系统不相容,而导致启动子无法驱动协助载体基因(helper genes)及报告基因的表达.目前,Kimura 实验室及美国的一个实验室正在尝试以来自鳞翅目昆虫Trichoplusia ni的piggyBac转座子进行蜜蜂的转化工作(Robert son).寻找可在目的昆虫基因组中移动的转座子或病毒成为建立转基因技术体系的重要前期工作.已证明Mariner转座子载体是理想的昆虫转基因载体,有潜力发展为蜜蜂转基因载体. Mariner转座子是一类DNA型转座子,在转座子分类上属于Tc12mariner转座子总科[16]. Mariner反向末端重复序列(inverted terminal repeat s,ITR)为28-30bp,含一个全长约1.3kb的无内含子的转座酶基因(编码约345个AA),转座酶识别位点为TA,转座插入时会将TA加倍.Mariner转座子广泛存在于酵母、植物界和动物界许多物种的基因组中[16].已有诸多把Mariner转座子转基因载体的报道,用之成功转化的生物包括原核生物、无脊椎动物、脊椎动物和植物.其中已转化的细菌有大肠杆菌、分支杆菌、螺旋菌、弧菌、奈瑟球菌[17—20];已转化的原生动物有利什曼球虫[21];已转化的无脊椎动物包括多个果蝇属、蚊子、家蚕、家蝇等[22—28];已转化的脊椎动物有鸡和斑马鱼(Reviewed by Lozovsky等,2002)[29,30].与其他昆虫转化系统,如p因子、hobo因子、Hermes因子、Mino s因子、piggyBac因子相比,Mariner转化系统的优点是能够转化多个物种、转化效率高,可携带1-12kb的外源DNA片断,而且整合进基因组中的外源基因在遗传上非常稳定[31].2　转基因蜜蜂的鉴定2.1　Sout hern印迹分析常见的转基因动物鉴定方法是Sout hern印迹分析.其方法是:取动物尾组织或血液,提取DNA,设计适当的引物,进行PCR扩增电泳,将PCR阳性产物转移到尼龙膜上,以同位素标记的外源基因片断作为杂交探针,对PCR阳性产物进一步确认.实践证明这种方法既省时又省力,但由于PCR方法有时存在假阳性,特别是扩增出内源性片断,对转基因个体筛选影响较大.消除假阳性关键在于引物的设计.近年来,一些新的鉴定转基因动物的方法也在不断出现.Met hol(1995)利用酪氨酸酶基因分析技术成功地检测了转基因小鼠[32].Kuiper等(1996)运用荧光定位杂交和缝狭印迹分析检测转基因猪也获得了成功[33].卢一凡等(1998)利用琼脂糖凝胶直接杂交鉴定低拷贝数转基因的方法,消除了常规方法Sout hern blot中因转膜不完全而造成的低拷贝数转基因鼠的丢失[34].2.2　转基因蜜蜂的筛选标记增强型绿色荧光蛋白(EGFP)是理想的转基因蜜蜂筛选标记.由Wimmer实验室开发出的3×P32EGFP被视为转基因昆虫的通用筛选标记[35].由于GFP在紫外线照射下能发出绿色荧光,所以,只要昆虫的表皮透光度高一点,可不必杀死虫子而在幼虫期,甚至在卵期就可判断转基因成功与否,可大大减轻对G0、G1和G2代的检测工作量.Tamura等(2000)以pig2 gyBac转座子载体对家蚕的生殖系的转化工作就是以家蚕肌动蛋白3(Actin3)基因的启动子来驱动EGFP标记基因的[36].能否将EGFP筛选标记用于蜜蜂转基因上,则取决于驱动GFP基因的蜜蜂基因启动子的克隆工作.3　转基因蜜蜂展望蜜蜂全基因组测序工作已由美国Texas A &M 大学Baylor 分院医学人类基因组测序中心完成,起初在Robinson 向N H GRI (National Human Genome Research Instit ute )提交的蜜蜂全基因组测序建议书中(http :///bee -r/HoneyBeeWhitePaper.p df ),他便指出蜜蜂全基因组测序将有益于人类健康,同时也有助于多种疾病药物的研究。