二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀法
丙酮沉淀：在0~4℃时，用10倍于蛋白质溶 液体积的丙酮加入到蛋白质溶液中，形成 沉淀后，立即分离，防止蛋白质变性 盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子 沉淀析出的过程称为“盐析”，它属于沉 淀法，目的是将所需要的蛋白质转入固相 沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分 离 免疫沉淀法：利用特异抗体识别相应抗原 蛋白质，以形成复合物从而分离蛋白质
上某种电荷基团形成的。
-+ -+
+
高分子聚合物基质
-
电荷基团
平衡离子
(2) 凝胶过滤（gel filtration chromatography）
凝胶层析是按照蛋白质分子量大小 进行分离的技术，又称之凝胶过滤、 分子筛层析或排阻层析
Gel filtration. This method separates proteins according to size.
蛋白质的分离、纯化和结构分 析
2401120102 黄嵩
蛋白质分离指利用其理化性质，
采取透析、盐析、电泳、层析以 及超速离心等不损伤蛋白质空间 构象的物理方法，以满足研究蛋 白质结构域功能的需要
一、透析和超滤法可除去蛋白质溶液中的小分 子化合物
利用透析袋分离蛋白质的方法叫透析发，透析袋是 具有超小微孔的膜，一般只允许分子量为10kD以下 的化合物通过，高分子蛋白则留在袋内
外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积 柱床体积为Vt 外水体积为Vo 内水体积为Vi 基质体积为Vg， 则有： Vt＝Vo＋Vi＋Vg 由于Vg相对很小，可以 忽略不计，则有： Vt＝Vo＋Vi
五、超速离心分离
超速离心法即可以用来分离纯化蛋白质也可 以用来测定蛋白质的分子量 蛋白质在高达50万g(g为gravity)的重力作用 下，在溶液中逐渐沉降，直至其浮力等于离 心力时，沉降停止 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示
异，柱介质是结合着带电基团的合成聚合物。
结合着阴离子的称为阳离子交换树脂(cation
exchanger), 结合阳离子的称为阴离子交换树
脂(anion exchanger)。

离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂 的结合力不同而进行分离纯化的。

离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于 水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合
利用聚丙烯酰胺凝胶内
的缓冲液在电场作用下在 凝胶内沿电场方向制造一 个pH梯度。 每种蛋白质都将迁移至 与它的pI 相一致的pH处。
Isoelectric focusing. This technique separates proteins according to their isoelectric points.

三、利用电泳法分离蛋白质

电泳（electrophoresis）
在外电场作用下，带电蛋白质将向与其电性相反的电
极移动的现象
一般不用于纯化大量蛋白 质，常作为一种分析手段
1) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)


聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），它以聚丙烯酰胺凝胶作为支 持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲 叉双丙烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由 基催化完成。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量：


目前几种测定蛋白质结构的方法 1、同源建模 被认为是目前最精确的方法 2、折叠识别 通过预测二级结构、预测折叠 方式和参考其他蛋白质的空间结构，从而产 生目标序列的三维结构 3、从无到有 根据单个氨基酸形成二级结构 的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产 生目标序列的三维结构
谢谢大家 黄嵩

沉降系数：生物大分子、亚细胞器和微生物等颗粒在单位离心
场中的沉降速度为沉降系数（s）。单位用S，即Svedberg单位，
为1×10-13秒。
dx / dt mp(1 v ) s 2 x f
（mp：颗粒质量；v ：偏微比容；：溶剂密度；f：摩擦系数） S 与颗粒的质量和密度、溶剂的密度和粘度有关，可根据沉降 系数的不同来分离和检定生物大分子、亚细胞器和微生物。
四、相分配或亲和原理分离蛋白质
层析技术，亦称色谱技术，是利用混合物
中各组分的物理、化学、生物性质的差 别，使各组分以不同程度分布在两个相 中（其中一个相为固定的，称为固定相； 另一个相则流过此固定相，称为流动相） 并使各组分以不同速率随流动相移动， 从而达到分离各组分的效果。
(1) 离子交换层析（ion-exchange chromatography) 利用一定pH下不同蛋白质带电种类和电量的差
使用含有十二烷基硫酸钠（ SDS）和还原
剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋
白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟）， 通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基 的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂 可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还 原）
2) 等电聚焦（isoelectric focusing）
六、应用化学或反向遗传法分析多肽 链氨基酸来自列
第一步：分析蛋白质的氨基酸残基 第二步：测定多肽链的氨基末端和羧基末端 的氨基酸种类 第三步：将肽链水解成片断，分别进行分析， 然后测定各肽段的氨基酸排序，一般采用 Edman降解法 第四步：整合对比，得出肽链氨基酸排序 近年来也可以通过核酸来推演氨基酸排序
七、应用物理学、生物信息学原理测 定蛋白质空间结构
通常采用圆二色光谱(circular dichroism,CD)测定溶液状态下的蛋白质二 级结构含量 X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振 技术(nuclear magnetic resonance,NMR)研 究蛋白质三维空间结构 近年建立起来的二维核磁共振技术也已用于 测定蛋白质三维结构