5、杂交
1）杂交体系： 探针浓度：控制在0.5ng/ml或更低 杂交反应温度：低于Tm值15-25℃ 杂交时间：
2）预杂交及洗膜
杂交的特异性是影响杂交效果的重要因素，非特异性杂交的去除主 要是通过杂交前的预杂交和杂交后的洗膜完成。
预杂交：是在加入探针前用封闭剂封闭膜上的非特异性 位点。
常用封闭剂包括变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子DNA， 小牛胸腺DNA等；另一类是高分子化合物，如Denhardts
操作：将印迹后的固相膜放在含封闭剂的预杂交液中置于不浓度的溶 液中漂洗，以除去游离的及非特异性位点上结 合的探针。
分子杂交涉及三大内容：制备杂交探针；制备被检的 核酸或蛋白质样品；印迹及杂交。
一、Southern杂交步骤
（一）植物总DNA提取 （二）杂交探针的制备
探针：是经过特殊化合物标记的特定的核苷酸序列。 分为DNA探针和RNA探针，DNA探针又分为单链DNA探针
和双链DNA探针。 杂交探针制备包括：探针核苷酸序列的获取及标记两
酸（NTP）或脱氧三磷酸核苷酸（dNTP），以这些标记 的核苷酸作底物，通过酶促聚合反应，使标记物掺入 到多核苷酸链中，从而获得合适探针。 特点：放射自显影灵敏度高，压片时间短； 分辨力较低； 探针不能长期保存
（3）非放射性标记物
特点：敏感性较差；
稳定性好、分辨力高，检测所需时间短。对人和环境 无害。
生物素:是一种水溶性B族维生素，其分子中的戊酸羧 基经化学修饰可含有各种活性基团，它能与蛋白质、 核酸等多种物质发生偶联，从而使这些物质被生物素 标记。
生物素标记的探针可通过生物素-抗生物素蛋白的亲和 系统检出，也可通过生物素-抗生物素抗体的免疫系统 检出。
抗生物素蛋白可与酶、荧光素等物质结合，是抗生物 素蛋白被这些物质标记，杂交时，生物素标记探针与 被检的单链DNA中同源序列杂交，检出时，加入被酶等 标记物标记的抗生物素蛋白，生物素与被标记的抗生 物素蛋白特异结合，形成杂交DNA-生物素-抗生物素酶等标记物的杂交检出体系，根据抗生物素蛋白上的 标记物性质进行检出。
部分。
1、探针核苷酸序列的获取
鉴定转基因植株时应使用同源探针，常以转化的目 的基因作探针。
目的基因探针一般从载体质粒上切取。包括质粒DNA 的分离纯化；限制性内切梅切割；电泳分离酶切片 段；从凝胶中回收目的片段。
2、探针标记
（1）理想的标记物条件：
标记前后探针的基本结构相同，标记物不影响探针 的杂交特异性；
洗膜液的温度、离子强度及洗膜时间是影响洗 膜效果的三要素。
6、杂交信号的检出
放射性标记的探针通过放射自显影检出； 包括：感光材料曝光、显影、定影、水洗等
物细胞内并不存在； 便于检查
目前常使用的报告基因GFP，GUS，BAR，NPTII等
1、gfp（绿色荧光蛋白）基因
简介：绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧 光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体的、能 在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它是一种能接 受荧光辐射能并最终发射荧光的物质。
从水母中分离纯化的Gfp是由238个氨基酸残基组成的 单体蛋白，分子量26888Da，它在蓝光激发下能发出绿 光。
Gfp作报告基因的优点：
适用于各种生物的基因转化； 检查方法简便，无需底物、梅、辅因子等物质； 便于活体检测； 检测是可获得直观信息。
2、gus（β -葡萄糖苷酸酶）基因
检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好且操 作简便、省时；
稳定、安全、无环境污染； 经济。
标记物分为：放射性和非放射性两类 放射性标记物主要有32P、35S、125I、14C等； 非放射性标记物主要有生物素、地高辛、荧光素、
辣根过氧化物酶等.
（2）放射性标记物 制备核酸探针时使用的放射性标记物多为三磷酸核苷
Gus基因存在于某些细菌体内，是一种水解酶，能催化 许多β -葡萄糖苷酯类物质的水解。
检测方法：组织化学染色定位法 以X-Gluc为底物，通过显色反应可直接观察到组织器 官中gus基因的活性。在适宜的条件下，该酶可将XGluc水解成蓝色物质，此靛蓝染料使具有Gus活性的部 位或位点呈现蓝色，用肉眼或显微镜即可观察。
图28-3地高辛标记探针杂交体检出原理示意图
3、标记方法
放射性标记有体内标记法及体外标记法。体外 标记法包括化学法、酶法和PCR法
酶法：是先将标记物标记在核苷酸上，然后通 过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸 序列中，产生合适探针。
包括切口平移法及随机引物法。
PCR法：是利用Taq酶可将修饰的核苷酸掺入到 PCR产物中（如32P-dNTP、地高辛-dUTP荧光素 标记的dNTP）所得PCR产物可用作探针。
化学法：是通过标记物的活性基团与核酸分子 中的某种基团发生化学反应而继续标记，标记 物直接与核酸分子相连。
28-4切口平移法
28-5随机引物法
三、Southern印迹杂交
程序 1、植物总DNA的限制酶切 2、凝胶电泳分离酶切片段 3、凝胶中的DNA变性 4、印迹：毛细转移法和电转移法 5、杂交 6、杂交信号的检出
第九章 转基因植物的检查与鉴定
第九章 转基因植物的检查与鉴定
第一节 报告基因的表达检测 第二节 外源基因整合的Southern杂交鉴定 第三节 外源基因转录的Northern杂交检测 第四节 外源基因表达蛋白的检℃测
第一节 报告基因的表达检测
报告基因的两大特点： 表达产物及产物的类似功能在未转化的植
第二节 外源基因整合的Southern杂交鉴定
Southern杂交是以DNA或RNA为探针，检查DNA链，用于 外源基因整合的鉴定及分析。
具有灵敏度高（可检出1pgDNA样品）；特异性强（可 鉴别出20个碱基对左右的同源序列）的特点
根据杂交时所用的具体方法分为：印迹杂交、斑点或 狭缝杂交和细胞原位杂交等。